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Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A ConBr à uma proteÃna tetramÃrica presente em sementes de Canavalia brasiliensis e que possui afinidade para os aÃÃcares D-mannose e D-glucose. à vasto o uso desta lectina em ensaios biotecnolÃgicos devido as suas propriedades biolÃgicas. à comumente utilizada conjugada ao FITC, um fluorÃforo amplamente utilizado nas diversas Ãreas da biotecnologia para anexar um marcador fluorescente a proteÃnas atravÃs do grupamento amina. No entanto, a influÃncia deste fluorÃforo na atividade de tais proteÃnas precisa ser mais bem evidenciada. Essa pesquisa visou obter informaÃÃes sobre as alteraÃÃes na estrutura secundÃria da proteÃna ConBr nativa e conjugada com FITC, alÃm de iniciar um estudo desta lectina tambÃm conjugada com pontos quÃnticos. Amostras de ConBr nativa, conjugada com o FITC (ConBr-FITC (2%)), misturada com FITC na proporÃÃo de 2% em massa (ConBr/FITC (2%)), misturada com FITC na proporÃÃo de 20% em massa (ConBr/FITC (20%)) e processada mas nÃo conjugada com o FITC (ConBr-), foram analisadas por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) atravÃs da tÃcnica de reflectÃncia total atenuada (ATR). Foram realizados testes de atividade hemaglutinante especÃfica com ConBr nativa, ConBr-FITC (2%), ConBr/FITC (2%), ConBr- e ConBr conjugada com pontos quÃnticos (ConBr-QD Zn/Cd). A atividade hemaglutinante especÃfica nos extratos foi determinada usando-se suspensÃes de hemÃcias de coelho a 3% em placas de microtitulaÃÃo. Os dados obtidos nos ensaios de atividade especÃfica foram submetidos ao teste estatÃstico de Mann-Whitney. Quando os espectros de ConBr nativa e ConBr-FITC (2%) foram comparados, observou-se que o pico da lectina nativa referente Ãs estruturas de folhas β, nÃo sofreu qualquer modificaÃÃo quando a proteÃna foi conjugada com FITC, entreteanto, notou-se uma diminuiÃÃo da intensidade na regiÃo do espectro referente Ãs estruturas em α-hÃlice, o que permite inferir uma reduÃÃo da quantidade destas estruturas. Houve tambÃm um aumento de intensidade na regiÃo referente Ãs estruturas irregulares. Os espectros de ConBr nativa, ConBr- e ConBr/FITC (2%) nÃo sugeriram alteraÃÃes na estrutura secundÃria. Nos testes de atividade hemaglutinante especÃfica de ConBr nativa e ConBr-FITC (2%) houve uma diminuiÃÃo da atividade especÃfica para esta Ãltima em relaÃÃo a primeira e estes resultados demonstraram diferenÃa estatisticamente significativa entre si. ConBr nativa e ConBr- nÃo apresentaram diferenÃas estatÃsticas significativas entre si. A atividade de ConBr/FITC (2%) tambÃm nÃo apresentou diferenÃas estatÃsticas em relaÃÃo à ConBr nativa. Em conjunto, estes resultados contribuem e reforÃam a proposiÃÃo de que à a ligaÃÃo do FITC à proteÃna que promove a alteraÃÃo estrutural na regiÃo de α-hÃlice. A atividade especÃfica de ConBr-QD Zn/Cd diminuiu drasticamente quando comparada com a atividade de ConBr nativa, apresentando diferenÃa estatisticamente significativa entre estas amostras. AnÃlises estatÃsticas realizadas com os dados obtidos no teste de atividade especÃfica e anÃlise dos espectros de infravermelho sugerem alteraÃÃes na estrutura secundÃria da lectina ConBr conjugada ao FITC. PorÃm, ainda à necessÃria a elucidaÃÃo da natureza dessa alteraÃÃo e se essa à realmente devida à ligaÃÃo da proteÃna ao fluorÃforo. / ConBr is a tetrameric protein found in Canavalia brasiliensis seeds and has affinity for D-mannose and D-glucose carbohydrates. It is vast use of this lectin in biotechnological assays due their biological properties, and itâs used commonly linked to FITC, a fluorophore widely used in various fields of biotechnology to attach to proteins a fluorescent marker through amine grouping. However, the fluorophore influence in proteins activity must be further highlighted. This research aimed obtain informations about native ConBr secondary structure and FITC-conjugated changes and start a study of this lectin conjugated quantum dots also. Samples of native ConBr, ConBr-FITC conjugated (FITC-ConBr (2%)), ConBr mixed with the FITC proportion of 2% by mass (ConBr/FITC (2%)), ConBr mixed with FITC at 20 mass% (ConBr/FITC (20%)) and processed but not conjugated with FITC ConBr (ConBr-) were analyzed by Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR), mode ATR (Attenuated Total Refectance). The native ConBr, ConBr-FITC (2%), ConBr/FITC (2%), ConBr-, and conjugated quantum dots ConBr (QD ConBr-Zn / Cd) specific haemagglutinating activity were performed. The specific haemagglutinating activity in the extracts was determined using the rabbit erythrocytes suspensions at 3% in microtiter plates. The specific activity data were tested using the Mann-Whitney test. When the native ConBr and FITC-ConBr (2%) spectra were compared, it was found the peak of the native lectin relating to β-sheet structures not suffered modification when the protein was conjugated with FITC, but there was a intensity reduction in the spectrum region relating to α-helix structures, which allows a reduction in the amount these structures. There was an intensity increase of irregular structures also. Native ConBr, ConBr- e ConBr/FITC (2%) spectra suggested no changes in secondary structure. There was a ConBr-FITC (2%) hemagglutinating activity decrease and that result showed statistically significant difference to native ConBr. Native ConBr and ConBr- do not have significantly differences. The ConBr/FITC (2%) activity didnât showed statistical differences regarding native ConBr. These results contribute and reinforce the proposition that is the FITC binding to protein promotes the structural change in the α-helix region. The ConBr-QD Zn/Cd specific activity decreased compared with the activity of native ConBr, demonstrating statistically significant differences between these samples. Statistical analyzes using the data obtained in the specific activity test and infrared spectra analysis suggest lectin ConBr FITC-conjugated secondary structure changes. However, itâs still necessary elucidate the nature of this change, and whether this is really due to the protein-fluorophore binding.

Microfluidic technology is a rapidly progressing tool in biomedical engineering. Microfluidic devices are appreciated for their simplicity and production efficiency potential. Our research focuses on developing a microfluidic device capable of transfecting cells by applying shear stress to cause temporary membrane damage. The advantage of this physical method of transfection is the possibility of incorporating large molecules that cannot be inserted with more traditional chemical transfection methods, while avoiding the large fall in viability seen with other physical methods such as electroporation. Unlike previous groups, our device incorporates the use of microfluidic valves to allow tunability, and impedance sensing for cell membrane damage analysis. We achieve (95±5)% cell viability and up to (68±5)% efficiency in transfecting 3T3 cells with DNA-sized molecules. In future stages, we intend to add the device onto an existing cell-encapsulation device that is tasked with preparing therapeutic cells to be used in regenerative medicine applications.

A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus tem uma massa molecular de 3,6 MDa, determinada por ultracentrifugação analítica. Esta proteína possui uma estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias sem o grupo heme, denominadas linkers. A HbGp é caracterizada por apresentar uma alta resistência a auto-oxidação e uma alta estabilidade oligomérica quando submetida a condições de estresse, tais como, variações de temperatura, pH e adição de agentes químicos (ureia, GuHCl e surfactantes). A primeira parte dos resultados desse trabalho descreve a estabilidade oligomérica da oxi-HbGp na presença de ureia, no pH 7,0 monitorada pela sonda de fluorescência fluoresceína isotiocianato (FITC). Este estudo foi desenvolvido através do uso de várias técnicas espectroscópicas tais como: absorção óptica no UV-VIS, emissão de fluorescência estática e resolvida no tempo, anisotropia estática e decaimento de anisotropia. Os tempos de vida de emissão de fluorescência dos triptofanos e da sonda FITC foram obtidos. Os decaimentos dos triptofanos são multi-exponenciais com quatro tempos de vida, onde dois estão na faixa de picosegundos e dois na faixa de nanosegundos. Os decaimentos de emissão dos triptofanos da oxi-HbGp pura e da oxi-HbGp modificada com FITC são bastante similares. Na ausência do desnaturante e na presença de até 2,5 mol/L de ureia os tempos curtos são predominantes. Em 3,5 e 6,0 mol/L de ureia as contribuições dos tempos longos aumentam significativamente. O processo de desenovelamento da oxi-HbGp induzido pela ureia é caracterizado pela dissociação oligomérica da proteína e desnaturação das subunidades dissociadas. Os decaimentos de emissão da sonda para o sistema FITC-HbGp são também multi-exponenciais com três tempos de vida, onde um dos tempos, na faixa de nanosegundos, é semelhante ao da sonda livre em tampão de 3,9 ns. Com o aumento da concentração de ureia, as contribuições dos tempos longos aumentam implicando a remoção da supressão observada para a emissão da sonda no sistema HbGp-FITC. Por outro lado, os decaimentos de anisotropia são caracterizados por dois tempos de correlação rotacional, associados, respectivamente, ao movimento residual da sonda em relação à proteína. Na segunda parte desse trabalho a forma apo-HbGp, ou seja, a oxi-HbGp sem os grupos hemes foi estudada através de um conjunto de técnicas: eletroforese, ultracentrifugação analítica (AUC), espalhamento dinâmico de luz (DLS), absorção óptica no UV-Vis, dicroísmo circular (CD), fluorescência estática e resolvida no tempo, na ausência e na presença da sonda 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS). Além disso, a concentração da apo-HbGp foi determinada pelo método do ácido bicinconínico (BCA). A partir dessa concentração o coeficiente de extinção molar foi calculado utilizando a lei de Beer-Lambert. Os dados de AUC mostraram duas espécies em solução, correspondendo ao monômero d e trímero abc, com coeficientes de sedimentação em torno de 2,0 e 3,5 S, respectivamente. Pelos dados de DLS percebe-se que a forma apo-HbGp monitorada por longos períodos de tempo é muito instável quando comparada à oxi-HbGp. No estudo de fluorescência resolvida no tempo da apo-HbGp foi observado à predominância de tempos longos, uma vez que os grupos hemes que promovem a supressão da emissão de fluorescência dos triptofanos foram removidos. Três tempos de vida são observados sendo dois longos na faixa de nano-segundos e um na faixa de sub-nano-segundos. / The extracellular hemogobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) has a molecular mass of 3.6 MDa, determined by analytical ultracentrifugation. This protein has an oligomeric structure composed by 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers. This class of proteins has a high resistance to oxidation and high oligomeric stability when subjected to stressful conditions such as temperature variation, pH and addition of chemical agents (urea, GuHCl, and surfactants). The first part of the results of this work describes the oxy-HbGp oligomeric stability, in the presence of urea, at pH 7.0, monitored by fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence probe. This study was developed through the use of several spectroscopic techniques, such as, UV-VIS optical absorption, static and time-resolved fluorescence (time-correlated single photon counting TCSPC), static anisotropy and time-resolved anisotropy decay. Fluorescence lifetimes were monitored for both tryptophans and FITC and the corresponding emission decays were obtained. Tryptophan decays are multi-exponential with four characteristic lifetimes: two in the picosecond and two in the nanosecond time ranges. The tryptophan emission decays for pure HbGp and HbGp-FITC systems are quite similar. In the absence of denaturant, and up to 2.5 mol/L of urea, the shorter lifetimes predominate in the decay. At 3.5 and 6.0 mol/L of urea, the longer lifetimes increase significantly their contribution. Urea-induced unfolding process is characterized by protein oligomeric dissociation and denaturation of dissociated subunits. FITC emission decays for FITC-HbGp system are also multi-exponential with three lifetimes: two in the sub-nanosecond and one in the nanosecond range with a value quite similar to the free probe in buffer of 3.9 ns. Increase of urea concentration leads to increase of the longer lifetime contribution, implying the removal of the quenching of the probe emission observed for the native HbGp-FITC system. On the other hand, anisotropy decays are characterized by two rotational correlation times associated to the bound probe, and are due to some residual motion of the probe relative to the protein. In the second part of this work the apo-HbGp (oxy-HbGp without heme groups) was studied through a set of techniques: Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Analytical Ultracentrifugation (AUC), Dynamic Light Scattering (DLS), UV-VIS optical absorption, Circular Dichroism (CD), static and time-resolved fluorescence, in the absence and in the presence of 8-anilino-1-naphtalene-sulfonic acid (ANS) probe. Moreover, the apo-HbGp concentration was determined by Bicinchoninic Acid (BCA) method. Based on these protein concentration results, it was possible to determine spectrophotometrically the apo-HbGp molar extinction coefficient employing the Lambert-Beer law. AUC results showed two species in solution, corresponding to the monomeric and trimeric species, with sedimentation coefficients around 2.0 and 3.5 S, respectively. The DLS data showed that the apo-HbGp form is very unstable when monitored for long times as compared to the HbGp oxy-form. In the time-resolved fluorescence study of apo-HbGp the predominance of long lifetimes was observed. This occurs because the heme groups that promote the tryptophan quenching of fluorescence in the native HbGp were removed. Three lifetimes are observed, two long in the nanosecond and one in the sub-nanosecond time ranges.

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

Die Arbeit untersucht den Einfluss des pH - Wertes auf die Fluoreszenzintensität von Multischichtsystemen während des Beschichtungsvorgangs von Siliziumdioxidpartikeln mit kovalent an Polyallylaminhydrochlorid (PAH) gebundenem Rhodamin - B - Isothiocyanat. Durch eine konsequente Pufferung mit 2 -(N - Morpholino)ethansulfonsäure während der Beschichtung kann eine Verbesserung der Homogenität der Schichtbildung und eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität erreicht werden. Außerdem liegt eine lineare Steigerung der Fluoreszenzintensität proportional zur Anzahl der fluoreszenten Schichten vor. Weiterhin sollen kolloidale Partikel unter konstanter Pufferung zusätzlich zu Rhodamin – B – Isothiocyanat mit an PAH – gebundenem Fluoresceinisothiocyanat beschichtet werden. Dieses Farbstoffpaar weist bei Annäherung eine Fluoreszenzsteigerung durch einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer aus. Durch Variation von Schichtanzahl und Abstand wurden verschiedene Partikelpopulationen hergestellt, die sich in Ihrer Fluoreszenzintensität analog zu einem Bead Array Assay im Durchflusszytometer klar differenzieren lassen und dabei auch eine gleichmäßige Steigerung der Fluoreszenzintensität analog zur Anzahl der fluoreszenten Schichten aufweisen.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pre textuais aline franca.pdf: 261338 bytes, checksum: 26489ba3dd2eb948a58b73b531aee0b2 (MD5) Previous issue date: 2010-10-05 / The evaluation of the reproductive capacity of stallions and semen cooled and / or frozen is of fundamental importance in practical breeding of horses. Whereas predicting the fertility of a stallion is still a subjective decision, the present study was conducted to evaluate different staining techniques, as well as tests that assess the viability of semen in horses, studying the effects of the addition of cysteine and glutathione in plasma membrane integrity of sperm DNA, and to evaluate the effects of the addition of these antioxidants in preserving the viability of sperm undergoing incubation and refrigerated for short periods. We used semen from six stallions, wich were split into seven samples, one kept as control (Control Group) and other antioxidants cysteine was added at a ratio of 1.0 mM (Group C1, 0), 1.5 mM (Group C1, 5), 2.5 mM (Group C 2.5) and glutathione also at 1.0 mM (Group G1, 0), 1.5 mM (Group G1, 5) and 2.5 mM (Group G 2.5 ). All tests were performed every six hours. The three treatments were: Treatment I cooled to 12 &#8304;C for 12 hours (zero hour; 6h resf.; 12h resf.) Chilled in boxes; Treatment II incubated in a water bath at 37 &#8304;C for 12 hours (6h 37 ° C, 12h 37 ° C) and Treatment III - cooled and subsequently incubated, according to the treatments I and II. The evaluation of plasma membrane integrity was performed by staining eosine-nigrosin; acrosomal membrane by FITC-PSA and DNA by acridine orange. For each analysis were numbered 200 to 500 cells. The evaluation of the viability of sperm was performed by MTT assay according to Mosmann (1983). The results showed that antioxidants were effective (p <0.05) in keeping the DNA intact chromatin, especially glutathione. In the acrosome of antioxidants were protective, at times 18 and 24 hours, and in other treatments, no significant difference (p> 0.05) between control and treated groups. The MTT test showed that groups treated with antioxidants had absorbance values similar to those of control, showing positive effect (p <0.05) only when cooled by six o'clock in the cysteine group 2.5. In relation to the plasma membrane of spermatozoa stained with eosin-nigrosin, no protective effect of antioxidants in the samples. The values of their averages were close to the control group (p> 0.05). One factor was estimated that cooling per se, independent of the addition of antioxidants used, has been effective in protecting the sperm. And the incubation at 37 &#8304; C causes these cells, and the addition of cysteine and glutathione were efficient, if not protect, but to maintain the integrity of the factors evaluated, not causing more damage to sperm. / A avaliação da eficácia reprodutiva do garanhão e do sêmen resfriado e&#8260;ou congelado é de fundamental importância na prática reprodutiva dos eqüinos. Predizer a fertilidade de um garanhão constitui uma decisão subjetiva. O presente estudo foi realizado com o objetivo de testar diferentes técnicas de coloração, assim como testes que avaliem a viabilidade do sêmen de eqüinos, estudando os efeitos da adição de cisteína e glutationa na integridade da membrana plasmática, do DNA espermático, além de avaliar os efeitos da adição desses antioxidantes na preservação da viabilidade dos espermatozóides submetidos à incubação e refrigeração por curtos períodos. Foi utilizado sêmen de seis garanhões, que foram fracionados em sete amostras, sendo uma mantida como controle (Grupo Controle) e às outras foi adicionado os antioxidantes cisteína, na proporção de 1,0mM (Grupo C1,0); 1,5mM (Grupo C1,5); 2,5mM (Grupo C 2,5) e glutationa também na proporção de 1,0mM (Grupo G1,0); 1,5mM (Grupo G1,5) e 2,5mM (Grupo G 2,5). Todas as análises foram realizadas a cada seis horas. Os três tratamentos foram: Tratamento I resfriado a 12 °C, por 12 horas (zero hora; 6h resf.; 12h resf.), em caixas refrigeradas; Tratamento II incubado em banho-maria a 37 °C, por 12 horas (6h 37° C; 12h 37° C) e Tratamento III resfriado e posteriormente incubado, conforme os Tratamentos I e II. A avaliação da integridade da membrana plasmática foi feita pela coloração eosina-nigrosina; da membrana acrossomal pelo FITC-PSA e do DNA pela laranja de acridina. A avaliação da viabilidade do sêmen foi realizada pelo ensaio do MTT, de acordo com Mosmann(1983). Os resultados obtidos mostraram que os antioxidantes foram eficientes (p<0,05) em manter a cromatina do DNA intacta, especialmente a glutationa. Na membrana acrossomal houve proteção dos antioxidantes, nos momentos 18 e 24 horas, sendo que nos demais tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os grupos tratados e o grupo controle. O teste do MTT mostrou que os grupos tratados com antioxidantes tiveram valores de absorbância próximos aos do controle, mostrando efeito positivo (p<0,05) apenas quando resfriados por seis horas, no grupo cisteína 2,5. Em relação à membrana plasmática dos espermatozóides, corados por eosina-nigrosina, não houve efeito protetor dos antioxidantes nas amostras avaliadas. Um fator avaliado foi que o resfriamento, por si só, independente da adição dos antioxidantes utilizados, já foi eficaz em proteger os espermatozóides. E a incubação a 37&#8304; C causa danos a essas células, e a adição de cisteína e glutationa foi eficiente em, senão proteger, mas manter a integridade dos fatores avaliados, não causando mais danos aos espermatozóides.

Abstract Introduction This study evaluated the effect of the polymer polyvinylalcohol-carbazate (PVAC) on the bacteria Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa. PVAC is a polymer with a carbazate moiety that neutralizes free aldehydes and has shown great promise in stabilizing erythrocytes during long term storage. It has also been shown to reduce intraperitoneal adhesions after trauma. For this study, two Gram positive and two Gram negative bacteria strains were used with PVAC to evaluate its effect. Materials and methods PVAC was obtained from the research team at Ångström Laboratory, Uppsala. The bacteria were obtained from Clinical Microbiology and Hospital Hygiene, Academic Hospital, Uppsala. The methods used were spectrophotometric assessment of bacteria growth, use of FITC-conjugated PVAC to study adherence to bacteria, use of FITC-antibodies to study PVAC’s effect on bacterial adherence to erythrocytes and a qPCR for quantification of E. coli. Results and discussion PVAC displayed a clear effect of inhibition of bacteria growth in the study as shown by use of spectrophotometric assessment. Trials with FITC-PVAC showed that the polymer adheres directly to the bacteria, displaying a possible function of its inhibitory properties. The qPCR assay was able to detect the bacteria in all the dilutions used. Introduction This study evaluated the effect of the polymer polyvinylalcohol-carbazate (PVAC) on the bacteria Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa. PVAC is a polymer with a carbazate moiety that neutralizes free aldehydes and has shown great promise in stabilizing erythrocytes during long term storage. It has also been shown to reduce intraperitoneal adhesions after trauma. For this study, two Gram positive and two Gram negative bacteria strains were used with PVAC to evaluate its effect. Materials and methods PVAC was obtained from the research team at Ångström Laboratory, Uppsala. The bacteria were obtained from Clinical Microbiology and Hospital Hygiene, Academic Hospital, Uppsala. The methods used were spectrophotometric assessment of bacteria growth, use of FITC-conjugated PVAC to study adherence to bacteria, use of FITC-antibodies to study PVAC’s effect on bacterial adherence to erythrocytes and a qPCR for quantification of E. coli. Results and discussion PVAC displayed a clear effect of inhibition of bacteria growth in the study as shown by use of spectrophotometric assessment. Trials with FITC-PVAC showed that the polymer adheres directly to the bacteria, displaying a possible function of its inhibitory properties. The qPCR assay was able to detect the bacteria in all the dilutions used.

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