Escherichia coli produit diverses entérotoxines thermolabiles et thermostables. STb est une toxine de faible poids moléculaire résistant à la chaleur chargée de la diarrhée chez les animaux de la ferme. Une étude antérieure a montré que les cellules ayant internalisé la toxine STb provoquent un dysfonctionnement de la barrière épithéliale par des changements dans les protéines des jonctions serrées (TJ). Ces modifications contribuent probablement à la diarrhée observée. Pour mieux comprendre le mécanisme de l'augmentation de la perméabilité intestinale, nous avons traité les cellules du côlon humain (T84) avec la toxine purifiée STb une fois que les cellules ont été récoltées et les protéines extraites. Après l'utilisation d'une solution contenant 1% de Nonidet P-40 (un détergent non dénaturant, non ionique), nous avons étudié la distribution de la claudine -1, une protéine majeure des TJs, responsable de l'imperméabilité de l'épithélium, entre la membrane (NP40-insoluble) et le cytoplasme (NP40-soluble). En utilisant l’immunoblot et la microscopie confocale, nous avons observé que le traitement des monocouches de cellules T84 avec STb induit la redistribution de la claudine-1. Après 24h, les cellules cultivées en milieu faible en Ca+ (5 uM) et traitées par STb, ont montré qu’environ 40 % de plus de la claudine-1 se sont délogées dans le cytoplasme par comparaison au contrôle. En passant d’un milieu faible à un milieu contenant des quantités physiologiques de Ca++ (1,8 mM) nous avons observé une augmentation du taux de claudine- 1 délogé, comme la délocalisation comparable et ce, après 6h. Un milieu supplémenté avec la même concentration de Mg++ ou Zn++ n'a pas affecté le taux de délogement comparé au milieu contenant une faible teneur en Ca++. En utilisant des anticorps anti-phosphosérine et anti-phosphothréonine, nous avons observé que la perte des claudines-1 de la membrane a été accompagnée par une déphosphorylation de cette protéine des TJs. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré une importante redistribution de la claudine-1 dans les cellules traitées par la toxine STb. La perte de la claudine-1 phosphorylée de la membrane est susceptible d'être impliquée dans la perméabilité accrue observée. Les mécanismes par lesquels ces changements sont provoqués restent à élucider. / Enterotoxigenic Escherichia coli produce various heat-labile and heat-stable enterotoxins. STb is a low molecular weight heat-resistant toxin responsible for diarrhea in farm animals. A previous study demonstrated that cells having internalized STb toxin induce epithelial barrier dysfunction through changes in tight junction (TJ) proteins. These modifications contribute probably to the diarrhea observed. To gain insight into the mechanism of increased intestinal permeability we treated human colon cells (T84) with purified STb toxin after which cells were harvested and proteins extracted. Using a 1% Nonidet P-40 (a non-ionic, non-denaturing detergent)-containing solution we investigated the distribution of claudin-1, a major TJ protein responsible for the epithelium impermeability, between membrane (NP40-insoluble) and the cytoplasmic (NP40- soluble) location. Using immunoblot and confocal microscopy, we observed that treatment of T84 cell monolayers with STb induced redistribution of claudin-1. After 24h, cells grown in low Ca++-containing medium (5 μM) treated with STb, showed about 40% more claudin-1 in the cytoplasm compare to the control. Switching from low to physiological Ca++-containing medium (1,8 mM) increased the dislodgement rate of claudin-1, as comparable delocalization was observed after 6h. Medium supplemented with the same concentration of Mg++ or Zn++ did not affect the dislodgement rate compare to the low Ca++-containing medium. Using anti- phosphoserine and anti-phosphothreonine antibodies we observed that the loss of membrane claudin-1 was accompanied by dephosphorylation of this TJ protein. Overall, our findings showed an important redistribution of claudin-1 in cells treated with STb toxin. The loss of phosphorylated TJ membrane claudin-1 is likely to be involved in the increased permeability observed. The mechanisms by which these changes are brought about remain to be elucidated.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/11561 |
| Date | 04 1900 |
| Creators | Nassour, Hassan |
| Contributors | Dubreuil, Daniel |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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