A fast and direct surface plasmon resonance (SPR) method for the kinetic analysis of the interactions between peptide antigens and immobilised monoclonal antibodies (mAb) has been established. Protocols have been developed to overcome the problems posed by the small size of the analytes (< 1600 Da). The interactions were well described by a simple 1:1 bimolecular interaction and the rate constants were self-consistent and reproducible. The key features for the accuracy of the kinetic constants measured were high buffer flow rates, medium antibody surface densities and high peptide concentrations. The method was applied to an extensive analysis of over 40 peptide analogues towards two distinct anti-FMDV antibodies, providing data in total agreement with previous competition ELISA experiments.Eleven linear 15-residue synthetic peptides, reproducing all possible combinations of the four replacements found in foot-and-mouth disease virus (FMDV) field isolate C-S30, were evaluated. The direct kinetic SPR analysis of the interactions between these peptides and three anti-site A mAbs suggested additivity in all combinations of the four relevant mutations, which was confirmed by parallel ELISA analysis. The four-point mutant peptide (A15S30) reproducing site A from the C-S30 strain was the least antigenic of the set, in disagreement with previously reported studies with the virus isolate. Increasing peptide size from 15 to 21 residues did not significantly improve antigenicity. Overnight incubation of A15S30 with mAb 4C4 in solution showed a marked increase in peptide antigenicity not observed for other peptide analogues, suggesting that conformational rearrangement could lead to a stable peptide-antibody complex. In fact, peptide cyclization clearly improved antigenicity, confirming an antigenic reversion in a multiply substituted peptide. Solution NMR studies of both linear and cyclic versions of the antigenic loop of FMDV C-S30 showed that structural features previously correlated with antigenicity were more pronounced in the cyclic peptide.Twenty-six synthetic peptides, corresponding to all possible combinations of five single-point antigenicity-enhancing replacements in the GH loop of FMDV C-S8c1, were also studied. SPR kinetic screening of these peptides was not possible due to problems mainly related to the high mAb affinities displayed by these synthetic antigens. Solution affinity SPR analysis was employed and affinities displayed were generally comparable to or even higher than those corresponding to the C-S8c1 reference peptide A15. The NMR characterisation of one of these multiple mutants in solution showed that it had a conformational behaviour quite similar to that of the native sequence A15 and the X-ray diffraction crystallographic analysis of the peptide - mAb 4C4 complex showed paratope - epitope interactions identical to all FMDV peptide - mAb complexes studied so far. Key residues for these interactions are those directly involved in epitope - paratope contacts (141Arg, 143Asp, 146His) as well as residues able to stabilise a particular peptide global folding. A quasi-cyclic conformation is held up by a hydrophobic cavity defined by residues 138, 144 and 147 and by other key intrapeptide hydrogen bonds, delineating an open turn at positions 141, 142 and 143 (corresponding to the Arg-Gly-Asp motif). / Se diseñó un método rápido y sencillo para el análisis cinético por resonancia de plasmón superficial (RPS) de las interacciones entre antígenos peptídicos de bajo peso molecular (< 1600 Da) y anticuerpos monoclonales (AM) inmovilizados en la superficie de un chip sensor. Dichas interacciones se ajustaron a un modelo de interacción bimolecular 1:1 y las constantes cinéticas obtenidas resultaron fiables y reproducibles. Los parámetros clave para la calidad de las constantes cinéticas medidas fueron un flujo de tampón elevado, una densidad superficial de AM intermedia y una elevada concentración de péptido. El método se extendió a más de 40 análogos peptídicos frente a dos AM contra el virus de la fiebre aftosa (VFA), obteniéndose total correlación con datos anteriores de ELISA competitivo.Se sintetizaron once pentadecapéptidos con todas las combinaciones posibles de las cuatro mutaciones que caracterizan el bucle GH del aislado C-S30 del VFA respecto a la secuencia de referencia C-S8c1. Los resultados del análisis cinético directo, por RPS, de la antigenicidad de estos péptidos frente a tres AM sugirieron que dichas combinaciones eran aditivas, observación que fué confirmada por ELISA competitivo. Así, el tetramutante (A15S30) que mimetiza el bucle GH de C-S30 resultó ser el peor antígeno de la serie, en contraste con resultados anteriores con este aislado. Aumentando el tamaño del tetramutante de 15 a 21 aminoácidos no afectó significativamente su antigenicidad. En cambio, una incubación prolongada con el AM llevó a un aumento de reactividad no observado para otros análogos. Posiblemente una reordenación conformacional del péptido pudo conllevar a la formación de un complejo estable con el anticuerpo. Experimentos de RPS con un análogo cíclico del péptido A15S30 confirmaron una reversión en la antigenicidad del tetramutante inducible a través de restricciones conformacionales. Estudios de ambos péptidos, lineal y cíclico, por resonancia magnética nuclear (RMN) mostraron que características estructurales anteriormente correlacionadas con la antigenicidad eran más pronunciadas en el análogo cíclico.Se prepararon veintiseis péptidos con todas las posibles combinaciones de cinco sustituciones específicas en el bucle GH del VFA C-S8c1. Dichas sustituciones individuales habían sido objeto de estudios anteriores, obteniéndose una elevada antigenicidad para los correspondientes péptidos mutantes frente a AM anti-VFA. No se pudo sistematizar el análisis cinético por RPS de los nuevos mutantes multiples, debido a problemas tanto en la determinación de las constantes cinéticas de disociación, como en la regeneración de las superficies de AM. Se utilizó así la RPS para la determinación de la afinidad péptido - AM en solución, obteniéndose antigenicidades comparables o incluso superiores a las del péptido nativo A15 (VFA C-S8c1). Se estudió uno de los mutantes multiples (A15FPS) por RMN, observándose una conformación identica a la del péptido nativo. El estudio del complejo cristalino entre el péptido A15FPS y el AM 4C4 por difracción de RX mostró que las interacciones parátopo - epítopo eran similares a las observadas con el péptido nativo. Se concluyió que los residuos clave para el reconocimiento son tanto aquellos involucrados en contactos directos (141Arg, 143Asp, 146His) como aquellos que estabilizan el plegamiento adecuado del péptido. Así, una conformación casi cíclica es soportada por una cavidad hidrofóbica definida por los residuos 138, 144 y 147 y por puentes de hidrógeno intra-peptídicos clave, diseñándose un bucle abierto centrado en las posiciones 141, 142 and 143 (triplete Arg-Gly-Asp).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/2793 |
| Date | 23 November 2000 |
| Creators | Carvalho Gomes, Paula Alexandra de |
| Contributors | Andreu Martínez, David, Universitat de Barcelona. Departament de Química Orgànica |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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