Kanalrhodopsine (ChRs) sind eine Gruppe von lichtgesteuerten Ionenkanälen, die ursprünglich aus motilen Algen stammen. In ihren nativen Organismus vermitteln sie die Bewegung zu optimalen Lichtbedingungen. In der biologischen Forschung hingegen werden ChRs eingesetzt, um die Erregbarkeit spezifischer Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung optisch zu steuern, ein Forschungsfeld, was als Optogenetik bezeichnet wird. Es wurden zahlreiche ChRs mit unterschiedlichen Eigenschaften charakterisiert und entwickelt, darunter solche, die selektiv für H+, Na+, K+ und Anionen sind. Im Gegensatz dazu sind bisher keine Ca2+-selektiven ChRs bekannt. In Anbetracht der Dominanz der von Kalzium in zellulären Signalwegen in allen Reichen des Lebens, würde ein Ca2+-leitendes ChR präzise Photokontrolle einer Vielzahl von zellulären Prozessen ermöglichen.
In dieser Arbeit wurden Chlamydomonas reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) Mutanten, die mit einer Erhöhung der Ca2+-Leitfähigkeit einhergehen, elektrophysiologisch charakterisiert und systematisch verglichen. Von den getesteten Varianten zeigten diejenigen, die eine Erhöhung der negativen Ladung am Selektivitätsfilter des Kanals, dem zentralen Tor, verursachen, erhebliche Auswirkungen auf die Leitfähigkeit für Ca2+ bei negativen Membranspannungen. Daraufhin wurden gezielt homologe Mutationen an mehreren verwandten ChRs eingeführt wodurch erfolgreich zwei Kalzium-durchlässige Kanalrhodopsine (CapChR1 und 2) erzeugt werden konnten. Die erweiterte Charakterisierung der CapChRs ergab eine unterdrückte Na+-Leitfähigkeit und eine erhöhte Ca2+-Durchlässigkeit bei negativen Spannungen. Bei niedrigen extrazellulären Konzentrationen des zweiwertigen Kations zeigten Kalzium-Imaging Experimente die Überlegenheit von CapChR2 bei der Vermittlung des durch Licht ausgelösten Ca2+-Einstroms in kultivierten Zellen. / Channelrhodopsins (ChRs) constitute a group of light-gated ion channels originating from
motile algae. In their native organisms, they mediate movement towards optimal light conditions. In biological research, ChRs are employed to optically control excitability of specific
cells with a high spatiotemporal resolution in a field commonly referred to as optogenetics.
Numerous ChRs with varying properties have been characterized and engineered, including
members that are selective for H+, Na+, K+ or anions. In contrast, no Ca2+-selective ChRs
have been reported to date. Given the dominance of calcium signaling across the kingdoms
of life, a Ca2+-conducting ChRs would enable precise photocontrol of a multitude of cellular
processes.
In this work, mutants of Chlamydomonas reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) associated
with an increase in Ca2+-conductance were characterized via electrophysiology and compared
systematically. Out of the tested variants, those increasing the negative electric charge at
the selectivity filter of the channel, the central gate, were found to have substantial effects
on the conductance for Ca2+ at negative membrane voltages. Subsequently, targeted mutations on several related ChRs were introduced in order to produce two calcium-permeable
channelrhodopsins (CapChR1 and 2). Extended characterization of the engineered CapChRs
revealed suppressed Na+ conductance and increased Ca2+ permeation at negative voltages. At low extracellular concentrations of the divalent cation, calcium imaging experiments demonstrated the superiority of CapChR2 in mediating light-triggered Ca2+-influx in cultured cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/27746 |
| Date | 08 August 2023 |
| Creators | Fernandez Lahore, Rodrigo Gaston |
| Contributors | Hegemann, Peter, Plested, Andrew, Friedrich, Thomas |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY 4.0) Attribution 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ |
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