Les ARN de transfert, éléments centraux de la traduction, présentent une grande variété de nucléosides modifiés dérivés des nucléosides canoniques (A, U, G et C), qui modulent la stabilité, la capacité de décodage et l’identité de ces molécules. t6A (thréonylcarbamoyl-N6-Adénosine) est un nucléoside hypermodifié retrouvé en position 37 (adjacent à l’anticodon) au niveau de tous les ARNt qui s’apparient aux codons de la forme ANN. Il joue un rôle essentiel dans la fidélité de traduction à travers deux fonctions principales : (i) il intervient dans le maintien de la bonne conformation de la boucle anticodon ; (ii) il facilite l’appariement codon/anticodon afin d’éviter le décalage de cadre de lecture durant la synthèse protéique. Ce nucléoside modifié est universel, présent chez les Archées, les Bactéries, les Eucaryotes, mais également chez les organites (mitochondries et chloroplastes), ce qui suggère que son apparition représente une acquisition évolutive importante et très ancienne, probablement antérieure au dernier ancêtre commun universel (LUCA). Pourtant, la voie de biosynthèse de t6A est restée inconnue pendant près de quarante ans.Récemment, des études de génétique ont montré que deux protéines universelles, Sua5/YrdC et Kae1/YgjD, sont nécessaires à sa synthèse chez Saccharomyces cerevisiae et Escherichia coli. Chez les Bactéries, la synthèse in vitro de t6A requiert la présence de deux autres protéines spécifiques à ce domaine du vivant : YeaZ et YjeE. Chez les Archées et les Eucaryotes, Kae1 (l’orthologue de YgjD) fait partie d’un complexe protéique conservé appelé KEOPS (pour Kinase Endopeptidase and Other Proteins of Small size), aux côtés de trois autres protéines : Bud32, Cgi121 et Pcc1, qui n’ont pas d’homologues chez les Bactéries. Depuis sa découverte en 2006 chez S.cerevisiae, ce complexe a été impliqué dans plusieurs processus cellulaires (homéostasie des télomères, maintien du génome, régulation de la transcription), sans que sa fonction ne soit clairement élucidée.Nous avons entrepris de caractériser et de comparer par une approche biochimique in vitro les machineries de biosynthèse de t6A issues des trois domaines du vivants, en utilisant comme organismes modèles l’Archée Pyrococcus abyssi, l’Eucaryote Saccharomyces cerevisiae et la Bactérie Escherichia coli. (i) Nous avons montré pour la première fois que le complexe KEOPS et la protéine Sua5 catalysent ensemble la synthèse de t6A chez les Archées et les Eucaryotes. Nos résultats nous ont permis d’élaborer un modèle de mécanisme catalytique, et nous avons montré par des expériences de complémentation in vitro que ce mécanisme est universel : les différents orthologues Sua5/YrdC sont interchangeables, et le complexe KEOPS est l’analogue fonctionnel du trio de protéines YgjD/YeaZ/YjeE Bactérien. (ii) Nous avons alors étudié le rôle de chacune des sous-unités du complexe KEOPS de Pyrococcus abyssi dans la synthèse de t6A. Ainsi, nous avons montré que Kae1 est le seul composant catalytique stricto sensus et que les trois autres partenaires ont des fonctions distinctes dans la régulation de l’activité catalytique. (iii) Enfin, nous avons étudié la synthèse de t6A chez la mitochondrie de S.cerevisiae, et avons montré que Sua5 et la protéine Qri7, l’orthologue mitochondrial de Kae1/YgjD, catalysent ensemble la synthèse de t6A et constituent ainsi un système minimaliste à deux composants.Ces résultats ouvrent la voie à une compréhension détaillée du mécanisme de biosynthèse de t6A dans les trois domaines du vivant, et permettent de proposer des scénarii évolutifs concernant l’histoire de la machinerie de synthèse de ce nucléoside modifié universel. / Transfer RNA are central elements of the translational system and carry a large diversity of modified nucleosides (derived from canonical nucleosides A, U, G, and C), which tune the stability, the decoding capacity and the identity of these oligonucleotides. t6A (threonylcarbamoyl-N6- adenosine) is a hypermodified nucleoside found at the position 37 (next to the anticodon) in all tRNA decoding ANN codons. It plays an essential role in the fidelity of translation through two main functions: (i) it ensures a correct conformation of the anticodon loop; (ii) it enhances codon/anticodon pairing to prevent frameshifting during translation. This nucleoside is universal, found in Archaea, Bacteria, Eukarya and also in organites such as mitochondria, which suggests that it appeared early in the evolution, probably before the last universal common ancestor (LUCA). Despite the importance of t6A and its distribution, its biosynthetic pathway has remained unknown for almost 40 years.Recently, genetic studies have shown that two universal proteins, Sua5/YrdC and Kae1/YgjD, are both necessary for synthesis of t6A in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. In Bacteria, the in vitro synthesis of t6A requires two other bacterial specific proteins called YeaZ and YjeE. In Archaea and Eukarya, Kae1 (the YgjD orthologue) is a part of a conserved protein complex called KEOPS (for Kinase Endopeptidase and Other Proteins of Small size), with three other proteins Bud32, Cgi121 and Pcc1, that have no bacterial homologues. Since its discovery in 2006 in yeast, this complex has been involved in several cellular processes (telomere homeostasis, genome maintenance, transcription regulation), but its real function remained unclear.Using an in vitro biochemical approach we aimed to characterize and compare the t6A biosynthesis systems from the three domains of life, using as model organisms Pyrococcus abyssi (Archaea) Saccharomyces cerevisiae (Eukarya), and Escherichia coli (Bacteria). We have reconstituted for the first time an in vitro system for t6A modification in Archaea and Eukarya, using purified KEOPS and Sua5. This allowed us to propose a model for the catalytic mechanism, and using in vitro complementation experiments we demonstrated that this mechanism is universal: Sua5/YrdC orthologues are interchangeable, and the KEOPS complex is the functional analogue of the bacterial trio YeaZ/YgjD/YjeE. In the second part of this work we have studied the role of each sub unit in the synthesis of t6A. Using KEOPS from P. abyssi as model we demonstrated that Kae1 is the only catalytic component while the three other partners have distinct functions in dimerization, tRNA binding and allosteric regulation. Finally, we have focused on the t6A synthesis in the mitochondria of S.cerevisiae, and shown that Sua5 and Qri7, the mitochondrial orthologue of Kae1/YgjD, catalyze together the synthesis of t6A and so represent a minimal two-component system.Overall these findings shed light on the reaction mechanism of t6A synthesis in the three domains of life, and allowed proposing a scenario concerning the history of the t6A synthesis machinery and its evolution.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013PA112093 |
| Date | 25 June 2013 |
| Creators | Perrochia, Ludovic |
| Contributors | Paris 11, Forterre, Patrick |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
Page generated in 0.0025 seconds