Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) spielt eine zentrale Rolle bei kardialen Remodeling-Prozessen infolge von Kardiomyopathie und schwerer Herzinsuffizienz. Das UPS ist für die Protein-Homöostase zuständig, indem es fehlerhafte und fehlgefaltete Proteine durch eine gezielte Markierung mit Ubiquitin dem proteasomalen Abbau zuführt. Die Ultima-Ratio-Therapie von Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz ist bis heute die Herztransplantation. Aufgrund der geringen Verfügbarkeit von Spenderherzen ist die Suche nach Alternativen von außerordentlicher Wichtigkeit. Um mögliche neue Therapiestrategien für Kardiomyopathie und schwere Herzinsuffizienz zu entwickeln, ist es deshalb von zentraler Bedeutung das UPS im humanen Myokard zu charakterisieren, um die Zusammenhänge zwischen dem UPS und der Herzmechanik genauer zu verstehen und auf diese therapeutisch einwirken zu können. Die vorliegende Arbeit untersuchte erstmalig das UPS bei fortgeschrittener ischämischer (ICM) und dilatativer Kardiomyopathie (DCM), den beiden häufigsten Indikationen für eine Herztransplantation.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktionsweise des UPS anhand spezifischer Marker genauer untersucht. Zu den untersuchten UPS-Komponenten zählen die Aktivität des Proteasoms, die Ubiquitinierung und die E1-E2-E3-Enzymkaskasde, über die eine Ubiquitinierung erfolgt. Für die Untersuchungen wurden Myokardproben von n=24 ICM- und n=28 DCM-Patienten verwendet, welche im Rahmen der Implantation eines linksventrikulären Herzunterstützungssystems gewonnen wurden. Als Kontrolle (n=12) diente Septumgewebe aus Morrow-Resektionen von Patienten mit Aortenstenose jedoch ohne diagnostizierte hypertrophe Kardiomyopathie und ohne Subaortenstenose. Mittels Western-Blot-Analysen wurde die Ubiquitinierung von Proteinen, die Aktivität der E3-Ligasen Muscle RING-finger protein-1 (MuRF-1) und Muscle atrophy F-box (MAFbx) sowie der Ubiquitin-Linker K48 (Proteasomaler Abbau) und K63 (Autophagie-assoziiierte Prozesse) untersucht. Weiterhin wurde die Aktivität des Trypsin- und Chymotrypsin-ähnlichen katalytischen Zentrums des Proteasoms quantifiziert. Die Aktivität der Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH)-Oxidase wurde ermittelt, um Rückschlüsse auf die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ziehen zu können. Des Weiteren wurde die Ubiquitinierung sowie das Auftreten möglicher apoptotischer Vorgänge durch den Nachweis des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) analysiert.
ICM- und DCM-geschädigtes Myokard wies deutliche Unterschiede bezüglich verschiedener Komponenten des UPS auf. In ICM- und DCM-Gewebe konnte eine Abnahme des zellulären, freien Ubiquitins im Vergleich zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden (p=0,05). ICM-geschädigtes Myokard wies darüber hinaus einen geringen Anteil von Zellen mit Ubiquitin-positiven Ablagerungen, sogenannten Deposits, auf (p=0,03). Die Multi-Ubiquitinierung von Proteinen war im Myokardgewebe von DCM-Patienten deutlich verringert (p=0,02), die Proteinubiquitinierung über K48 und K63 jedoch zwischen den Gruppen vergleichbar. Eine Quantifzierung der verschiedenen katalytischen Zentren des Proteasoms zeigte nur einen statistischen Trend für eine verringerte Aktivität des Trypsin-ähnlichen katalytischen zentrums in ICM-geschädigtem Myokard. Die Expression der E3-Ligasen MAFbx und MuRF-1 unterschied sich nicht zwischen den Gruppen. Im Vergleich zur Kontrolle wiesen die Myokardproben der ICM-Patienten eine verringerte NADPH-Oxidase-Aktivität auf (p=0,01), was auf eine verringerte ROS-Produktion hinweist. Jedoch unterschied sich der Anteil AIF-positiver Zellen und damit die Caspase-unabhängige Apoptose nicht zwischen den Gruppen.
Die vorliegende Arbeit zeigt erstmalig, dass sich die Aktivität und Expression verschiedener Komponenten des UPS in ICM und DCM unterscheiden. Deshalb liefern die vorliegenden Daten verschiedene Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer therapeutischer Interventionen für die Herzinsuffizienz, um den Bedarf an Spenderherzen zukünftig senken zu können:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Kardiomyopathien 1
1.1.1 Dilatative Kardiomyopathie 4
1.1.2 Ischämische Kardiomyopathie 5
1.2 Kardiales Remodeling 6
1.3 Das Ubiquitin-Proteasom-System 8
1.3.1 Das Proteasom 9
1.3.2 Ubiquitin 10
1.3.3 E1-E2-E3-Enzymkomplex 10
1.3.4 Deubiquitinasen (DUBs) 12
1.4 Therapie 13
2 Zielsetzung 14
3 Material 15
4 Methoden 23
4.1 Probengewinnung 23
4.1.1 Probengewinnung bei LVAD-Implantation 23
4.1.2 Probengewinnung im Rahmen von Morrow-Resektionen 24
4.2 Verarbeitung der Proben 25
4.3 Proteinextraktion und Bestimmung der Proteinkonzentration 26
4.4 Auftrennung von Proteinen durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 27
4.5 Western-Blot 28
4.6 Immunhistologische Färbungen 30
4.6.1 Ubiquitin-Färbung 30
4.6.2 Färbung des Apoptose-induzierenden Faktors AIF 31
4.6.3 Hämatoxylin/Eosin-Färbung 31
4.7 Proteasomaktivitätsmessung 32
4.8 NADPH-Oxidase-Aktivitätsmessung 33
4.9 Statistik 34
5 Ergebnisse 35
5.1 Translation von Proteinen 35
5.2 Proteasomaktivität 36
5.3 Expression der E3-Ligasen 38
5.4 Ubiquitinierung 39
5.5 Oxidativer Stress und Apoptose 45
6 Diskussion 49
7 Zusammenfassung 60
8 Literaturverzeichnis 61
9 Abkürzungsverzeichnis 67
10 Abbildungsverzeichnis 69
11 Tabellenverzeichnis 70
Eigenständigkeitserklärung 71
Lebenslauf 72
Danksagung 73
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:73259 |
| Date | 23 December 2020 |
| Creators | Kellermann, Kristina |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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