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Previous issue date: 2011-12-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Kluyveromyces marxianus são leveduras promissoras para a fermentação de glicose e xilose, os principais açúcares presente no hidrolisado de bagaço de cana. No presente trabalho, foi investigado o consumo de xilose em presença de glicose bem como a capacidade de K. marxianus em fermentar várias combinações desses dois açúcares. Células de K. marxianus UFV-3 cultivadas em 20 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose apresentaram um período de adaptação de 30h para o início do consumo da xilose, após a glicose ter sido totalmente consumida. Entretanto, esse período de adaptação não foi observado quando as células foram cultivadas em 5 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose. Nessas condições, as células começaram a consumir xilose logo após a glicose ter sido exaurida do meio. Além disso, foi demonstrado que glicose e xilose podem ser consumidas simultaneamente, quando a respiração é bloqueada. A produção de etanol foi maior quando em mistura de glicose e xilose comparado à glicose sozinha. Por outro lado, K. marxianus UFV-3 não foi capaz de produzir etanol a partir de xilose nas condições avaliadas. Visando selecionar uma linhagem capaz de fermentar xilose, células de K. marxianus UFV-3 foram submetidas à engenharia evolutiva. Mutagênese foi aplicada com o intuito de aumentar a variabilidade genética da população e diminuir o tempo de seleção. Duas técnicas para inserção de mutações aleatórias foram utilizadas: REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição) e radiação ultravioleta (UV). Populações mutantes foram submetidas à seleção em quimiostatos e em bateladas sequenciais. Em quimiostato conduzido sob hipoxia, com uma taxa de diluição de 0.15 h-1 e uma mistura de 5 gL-1 glicose e 10 gL-1 xilose, isolou- se um mutante da população de células submetidas à REMI (KmRhyp). Este isolado produziu 12% mais etanol que a linhagem selvagem, mas com dobro de xilitol. Em batelada sequencial foi isolado um mutante da população irradiada por UV (KmUVsb) capaz de formar etanol de xilose e produzir menor quantidade de xilitol que a linhagem selvagem. Diferenças entre a linhagem selvagem e KmUVsb foram relacionadas a diferenças observadas na atividade de algumas enzimas. A razão entre as atividades específicas da xilitol desidrogenase e da xilose redutase foi maior para a linhagem mutante. As atividades específicas das enzimas da via fermentativa: piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase também foram maiores em KmUVsb. Culturas conduzidas em quimiostato limitado por xilose sob condições de aerobiose foram submetidas a um pulso de glicose (50 mmoles.L-1). Nem a linhagem selvagem nem a mutante produziram etanol instantaneamente, confirmando efeito Crabtree-negativo. Etanol foi detectado no sobrenadante após 60 minutos, e a produção deste metabólito foi duas vezes maior na linhagem mutante. Além disso, KmUVsb foi capaz de crescer em anaerobiose estrita na presença de xilose como única fonte de carbono. / Kluyveromyces marxianus strains are promising candidates to ferment glucose and xylose, the main sugars in hydrolyzed sugarcane bagasse. In this work, it was investigated the xylose consumption in the presence of glucose and the K. marxianus UFV-3 ability to ferment various combinations of these two sugars. K. marxianus UFV-3 cultured on 20 gL-1 glucose and 20 gL-1 xylose presented a lag phase of 30h to start xylose consumption after glucose depletion. However, this period of adaptation was not observed when cells were grown on 5 gL -1 glucose and 20 gL-1 xylose. Under these conditions, the cells began to consume xylose after glucose had been exhausted. Furthermore, it was demonstrated that glucose and xylose can be consumed simultaneously, when respiratory chain is blocked. The ethanol production was higher in a glucose/ xylose mixture compared to glucose alone. K. marxianus UFV-3 was not able to produce ethanol from xylose. In order to select a strain able to ferment xylose, K. marxianus UFV-3 were subjected to evolutionary engineering. Mutagenesis was applied to increase the genetic variability of the population and to reduce the selection time. Two methods for random mutations were used: REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) and ultraviolet irradiation (UV). Mutant populations were subjected to selection in chemostats and sequential batches. In chemostats conducted under hypoxia, with a dilution rate of 0.15 h -1 in a 5 gL-1 glucose and 10 gL-1 xylose mixture, a mutant from REMI population was isolated (KmRhyp). The isolate produced 12% more ethanol but with twice xylitol compared to the wild type. In sequential batches, it was isolated a mutant from the UV irradiated population (KmUVsb) which was able to form ethanol from xylose with 2-times less xylitol than wild type strain. The differences between wild type and KmUVsb were related to differences in the activity of some enzymes. The ratio of xylitol dehydrogenase specific activity to xylose reductase specific activity was higher in the mutant strain. The specific activities of fermentative pathway enzymes: pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase were also higher in KmUVsb. Cultures conducted in xylose- limited chemostats under aerobiosis were subjected to glucose pulse (50 mmoles/L). Neither the wild type nor the mutant strain formed ethanol instantly, confirming Crabtree-negative effect. Ethanol was detected on the supernatant after 60 minutes and it was twice as high as for mutant strain. In addition, KmUVsb was able to grow under strict anaerobiosis in the presence of xylose as the only carbon source.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/6579 |
| Date | 19 December 2011 |
| Creators | Santos, Valdilene Canazart dos |
| Contributors | Gombert, Andreas Karoly, Fietto, Luciano Gomes, Queiroz, Marisa Vieira de, Passos, Flávia Maria Lopes |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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