Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós–Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-03-11T15:16:39Z No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-03-18T13:36:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-18T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DacienedeArrudaGrossklaus.pdf: 2226412 bytes, checksum: a2beca3dd626165f4620dcfff4567b83 (MD5) / O fungo dimórfico Paracoccidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma doença adquirida pela inalação de conídios ou fragmentos de micélio que transitam para a fase patogênica, leveduriforme, nos pulmões do hospedeiro. Após a infecção, a sobrevivência do fungo depende da evasão do sistema imune e adaptação ao ambiente hostil do hospedeiro. Macrófagos alveolares são a primeira linha de defesa contra Paracoccidioides e para conter a infecção essas células produzem várias substâncias nocivas como o peróxido de hidrogênio (H2O2) que desencadeia o estresse oxidativo. Para investigar os efeitos que H2O2 causa no proteoma de Paracoccidiodes, foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2-DE) para analisar as proteínas diferencialmente expressas durante a resposta inicial (2 h) e tardia (6 h) ao H2O2. A análise 2-DE revelou um total de 179 proteínas/spots diferencialmente expressos (116 spots com expressão aumentada e 63 com expressão diminuída). As proteínas/spots diferencialmente expressas foram submetidas à identificação por meio da espectrometria de massas e submissão da massa monoisotópica dos peptídeos ao banco de dados do NCBI. Todos os spots/proteínas foram identificados com sucesso e agrupados de acordo com a categoria funcional - FunCat2. Resgate, defesa e virulência celular, metabolismo e energia foram as categorias com as maiores freqüências de proteínas/isoformas. Várias enzimas antioxidantes, como catalase, superóxido dismutase, peroxidases e tioredoxinas foram identificadas, bem como outras oxidoredutases que estão provavelmente envolvidas na resposta contra o estresse oxidativo. O perfil metabólico foi caracterizado, verificando-se ativação da via das pentoses fosfato, uma importante fonte geradora de NADPH celular. No intuito de confirmar os dados proteômicos, ensaios confirmatórios de atividade enzimática, citometria de fluxo e análises dos níveis transcricionais e de NADPH foram realizados e se mostraram concordantes com os dados obtidos na análise proteômica. Os resultados sugerem que Paracoccidioides possui um amplo repertório antioxidante, composto por diferentes proteínas que atuam de maneira complementar, que foram capazes de detoxificar as EROs e de minimizar os efeitos causados pelo estresse oxidativo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis, a disease acquired by inhalation of infective airborne conidia or mycelia fragments that transit to the pathogenic yeast phase in the host lungs. Upon infection, fungal survival depends on evasion from the immune system and adaptation to the host environment. Alveolar macrophages are the first defense cells line against Paracoccidioides and aiming to restrict the fungal infection, macrophages produce several harmful substances, such as hydrogen peroxide (H2O2) that triggers oxidative stress. To investigate the effect of H2O2 on the proteome of Paracoccidiodes, we used a large scale 2-DE protein gel electrophoresis approach to analyze differentially expressed proteins that were detected in early (2 h) and in late (6 h) H2O2-treatments. The 2-DE analysis revealed a total 179 spots differentially expressed (116 proteins spots with increased expression and 63 with decreased expression). Differentially expressed proteins were subjected to identification by mass spectrometry and by submi tting the monoisotopic mass of the peptides to the NCBI non reduntand database. All spots were successfully identified and they were grouped according the functional category - FunCat2. Cell rescue, defense and virulence, metabolism and energy were the categories that showed the most number of occurrences of the proteins/isoforms. Several antioxidant enzymes, such as catalase, superoxide dismutase, peroxidases and thioredoxins were identified, as well as others oxidoreductases putatively involved with defense against oxidative stress. A view of the metabolic cell profile depicted an activation of the pentose phosphate pathway, a great source of cellular reducing power in the form of NADPH. Confirmatory assays of enzymatic activity, flow cytometry, transcript levels and NADPH measurements, produced data in agreement with proteomic analysis. The results indicated that Paracoccidioides has several antioxidant systems, including various proteins that complementarlly were able to detoxified ROS and minimized the damage triggered by oxidative stress.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T12:34:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875901 bytes, checksum: 7f1d304af718ecd82eb71caef248e486 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T12:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875901 bytes, checksum: 7f1d304af718ecd82eb71caef248e486 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Kluyveromyces marxianus são leveduras promissoras para a fermentação de glicose e xilose, os principais açúcares presente no hidrolisado de bagaço de cana. No presente trabalho, foi investigado o consumo de xilose em presença de glicose bem como a capacidade de K. marxianus em fermentar várias combinações desses dois açúcares. Células de K. marxianus UFV-3 cultivadas em 20 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose apresentaram um período de adaptação de 30h para o início do consumo da xilose, após a glicose ter sido totalmente consumida. Entretanto, esse período de adaptação não foi observado quando as células foram cultivadas em 5 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose. Nessas condições, as células começaram a consumir xilose logo após a glicose ter sido exaurida do meio. Além disso, foi demonstrado que glicose e xilose podem ser consumidas simultaneamente, quando a respiração é bloqueada. A produção de etanol foi maior quando em mistura de glicose e xilose comparado à glicose sozinha. Por outro lado, K. marxianus UFV-3 não foi capaz de produzir etanol a partir de xilose nas condições avaliadas. Visando selecionar uma linhagem capaz de fermentar xilose, células de K. marxianus UFV-3 foram submetidas à engenharia evolutiva. Mutagênese foi aplicada com o intuito de aumentar a variabilidade genética da população e diminuir o tempo de seleção. Duas técnicas para inserção de mutações aleatórias foram utilizadas: REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição) e radiação ultravioleta (UV). Populações mutantes foram submetidas à seleção em quimiostatos e em bateladas sequenciais. Em quimiostato conduzido sob hipoxia, com uma taxa de diluição de 0.15 h-1 e uma mistura de 5 gL-1 glicose e 10 gL-1 xilose, isolou- se um mutante da população de células submetidas à REMI (KmRhyp). Este isolado produziu 12% mais etanol que a linhagem selvagem, mas com dobro de xilitol. Em batelada sequencial foi isolado um mutante da população irradiada por UV (KmUVsb) capaz de formar etanol de xilose e produzir menor quantidade de xilitol que a linhagem selvagem. Diferenças entre a linhagem selvagem e KmUVsb foram relacionadas a diferenças observadas na atividade de algumas enzimas. A razão entre as atividades específicas da xilitol desidrogenase e da xilose redutase foi maior para a linhagem mutante. As atividades específicas das enzimas da via fermentativa: piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase também foram maiores em KmUVsb. Culturas conduzidas em quimiostato limitado por xilose sob condições de aerobiose foram submetidas a um pulso de glicose (50 mmoles.L-1). Nem a linhagem selvagem nem a mutante produziram etanol instantaneamente, confirmando efeito Crabtree-negativo. Etanol foi detectado no sobrenadante após 60 minutos, e a produção deste metabólito foi duas vezes maior na linhagem mutante. Além disso, KmUVsb foi capaz de crescer em anaerobiose estrita na presença de xilose como única fonte de carbono. / Kluyveromyces marxianus strains are promising candidates to ferment glucose and xylose, the main sugars in hydrolyzed sugarcane bagasse. In this work, it was investigated the xylose consumption in the presence of glucose and the K. marxianus UFV-3 ability to ferment various combinations of these two sugars. K. marxianus UFV-3 cultured on 20 gL-1 glucose and 20 gL-1 xylose presented a lag phase of 30h to start xylose consumption after glucose depletion. However, this period of adaptation was not observed when cells were grown on 5 gL -1 glucose and 20 gL-1 xylose. Under these conditions, the cells began to consume xylose after glucose had been exhausted. Furthermore, it was demonstrated that glucose and xylose can be consumed simultaneously, when respiratory chain is blocked. The ethanol production was higher in a glucose/ xylose mixture compared to glucose alone. K. marxianus UFV-3 was not able to produce ethanol from xylose. In order to select a strain able to ferment xylose, K. marxianus UFV-3 were subjected to evolutionary engineering. Mutagenesis was applied to increase the genetic variability of the population and to reduce the selection time. Two methods for random mutations were used: REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) and ultraviolet irradiation (UV). Mutant populations were subjected to selection in chemostats and sequential batches. In chemostats conducted under hypoxia, with a dilution rate of 0.15 h -1 in a 5 gL-1 glucose and 10 gL-1 xylose mixture, a mutant from REMI population was isolated (KmRhyp). The isolate produced 12% more ethanol but with twice xylitol compared to the wild type. In sequential batches, it was isolated a mutant from the UV irradiated population (KmUVsb) which was able to form ethanol from xylose with 2-times less xylitol than wild type strain. The differences between wild type and KmUVsb were related to differences in the activity of some enzymes. The ratio of xylitol dehydrogenase specific activity to xylose reductase specific activity was higher in the mutant strain. The specific activities of fermentative pathway enzymes: pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase were also higher in KmUVsb. Cultures conducted in xylose- limited chemostats under aerobiosis were subjected to glucose pulse (50 mmoles/L). Neither the wild type nor the mutant strain formed ethanol instantly, confirming Crabtree-negative effect. Ethanol was detected on the supernatant after 60 minutes and it was twice as high as for mutant strain. In addition, KmUVsb was able to grow under strict anaerobiosis in the presence of xylose as the only carbon source.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-10T15:48:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 460318 bytes, checksum: 7e3afed1422c277bb9fda24ca28d8a9e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-10T15:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 460318 bytes, checksum: 7e3afed1422c277bb9fda24ca28d8a9e (MD5) Previous issue date: 2005-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente trabalho foi avaliar experimentalmente o crescimento de diferentes tipos de leveduras cervejeiras (Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces uvarum) em diferentes tipos de mosto (substratos), contendo arroz, milho, sorgo, maltose e cana como adjunto do malte em composição. Objetivou-se, assim, ve rificar se tais composições alteram a cinética de fermentação e a atividade de algumas enzimas durante o processo fermentativo em uma temperatura constante. Acompanhou-se também a presença de alguns metabólitos extracelulares (etanol, acetato e glicerol) e glicose, as características físico-químicas e microbiológicas (pH, atenuação, contagem de células, oBrix e densidade) e a qualidade sensorial das cervejas produzidas nas diferentes condições de substratos e leveduras relatadas anteriormente. Durante o preparo dos substratos foram determinados os teores de extrato dos mostos primários e mostos mistos, a massa dos mostos mistos e o rendimento da mosturação. Os processamentos das cervejas foram realizados pelos processos de duas massas e infusão. O mosto foi inoculado com leveduras de alta e baixa fermentação. A fermentação transcorreu a 12°C, sendo encerrada quando 80% do extrato fermentável foi consumido pelas leveduras. Amostras do caldo fermentativo foram coletadas em 0, 12, 24, 36, 60, 84, 108, 132, 156 e 180 horas, no transcorrer da fermentação. Por centrifugação, as células foram separados e posteriormente lisadas com pérolas de vidro e congeladas até o momento de análise. A quantificação enzimática (álcool desidrogenase, piruvato desidrogenase, isocitrato liase, fosfofrutoquinase, glutamato oxaloacetato transaminase e diacetil redutase) e dos metabólitos (etanol, glicerol e acetato) mais a glicose foram realizadas em testes de colorimetria em aparelho Cobas Fara. Na mosturação, o uso dos adjuntos açucarados (cana e xarope de high maltose) apresentou maior teor de mosto primário, maior teor de mosto misto, maior massa de mosto e maior rendimento, que represente a eficiência da mosturação e a taxa de hidrólise do amido em açúcares.Nas análises físico- químicas, o pH foi significativo para as variáveis individuais e não-significativo nas interações. Existiu diferença entre as leveduras na contagem de células, atenuação e extrato aparente. A formação de glicerol e etanol apresentou tendência de aumento ao longo do processo e a produção de acetato foi variável, com bastante oscilações. Constatou-se que o consumo de glicose inicia-se efetivamente após 60 horas. A atividade da álcool desidrogenase apresentou maiores picos de produção em cultivos com a levedura ale, em relação à levedura lager, o que não influenciou os níveis de etanol para as duas leveduras. As melhores atividades da piruvato desidrogenase no cultivo da levedura ale, foi nos substratos maltose, sorgo e cana e para lager nos substratos cana xarope de high maltose e arroz. Os maiores picos de produção da glutamato oxaloacetato transaminase foram detectados na levedura ale em cultivo em caldo de cana, xarope de high maltose e milho e na levedura lager, nos substratos caldo de cana, arroz e milho. A fosfofrutoquinase teve, para as duas leveduras, maiores atividades em cultivos no susbtratos arroz. As maiores atividades da isocitrato liase para levedura ale foi em cultivo nos substratos caldo de cana e sorgo e para levedura lager nos substratos arroz e xarope de high maltose. A maior atividade da diacetil redutase foi no cultivo em substrato sorgo e na levedura lager, no cultivo em substrato arroz. Os adjuntos açucarados apresentaram extratos superiores aos dos amiláceos. Entre os cereais não houve diferença significativa, o complexo amilolítico da levedura agiu igualmente para os três adjuntos. Todos os adjuntos testados são capazes de produzir meios adequados para produção de cerveja. Não há destaque na produção de etanol entre as leveduras, estando na faixa ideal para produção de cerveja. O glicerol não apresenta grandes variações, sendo ligeiramente superior na levedura ale. O acetato, até o final da fermentação (80% de consumo de açúcares), teve tendência de produzir cervejas mais ácidas, mas com possibilidade de diminuição caso a fermentação evoluísse até o final. Os substratos com diferentes constituições químicas influenciaram o comportamento enzimático nas duas leveduras. A atividade da álcool desidrogenase foi baixa, mas não influenciou a produção de etanol. A piruvato desidrogenase apresentou maiores atividades na levedura de alta fermentação, o que caracteriza uma possível maior disponibilidade de intermediário do ciclo de Krebs. Apesar de baixa, houve diferença nas atividades da isocitrato liase entre as duas leveduras, em substratos diferentes, o que deixa claro que maiores atividades em alguns substratos caracteriza a presença de metabólitos oriundos do desvio do ciclo do glioxalato, que pode, em certas situações, determinar uma via glicolítica mais fraca. A atividade da glutamato oxaloacetato transaminase está fortemente relacionada nesses testes com a formação de precursores (aminoácidos) de substâncias essenciais ao sabor da cerveja, em que a atividade apresenta-se mais baixa nas amostras de menor aceitação, com uso de escala hedônica. A atividade da fosfofrutoquinase apresentou-se baixa nas duas leveduras. Essa atividade baixa não influenciou a produção de substâncias como glicerol e etanol, porém picos de produção nos substratos testados indicam atividade glicolítica mais elevada, com potencial de produção de metabólitos- chaves que poderão ser usados em outras vias. A diacetil redutase, apesar de apresentar baixas atividades para as duas leveduras nos substratos, mostra maior potencialidade de redução do diacetil nos substratos sorgo e arroz. / The objective of this work was to experimentally eval uate the growth of different types of brewery yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum) in different types of worts (substrates) containing rice, corn, sorghum, maltose, and sugarcane as malt adjuncts in compositions to verify whether such compositions alter fermentation kinetics and the activity of some enzymes during the fermentative process at a constant temperature. The presence of some extra cellular metabolites (ethanol, acetate and glycerol) and glucose, physical- chemical and microbiological characteristics (pH, attenuation, cell count, oBrix and density) as well as the sensorial quality of the beer produced under the different substrate and yeast conditions previously reported, were also monitored. The contents of primary worts and mixed worts, mixed wort mass, and mosturation yield were determined during substrate preparation. Beer processing was carried out by applying the mass and infusion processes. The wort was inoculated with high and low fermentation yeasts. Fermentation occurred at a 12°C, ending when 80% of the fermentable extract was consumed by the yeasts. Samples of the fermentative juice were collected at 0, 12, 24, 36, 60, 84, 108, 132, 156 and 180 hours, throughout fermentation. The cells were separated by centrifugation, and later ruptured with glass pearls and frozen until analysis. Enzymatic quantification (alcohol dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, isocytrate lyase, phophofrutoquinase, glutamate oxaloacetate transaminase and diacetyl redutase) and metabolites (ethanol, glycerol and acetate) plus glucose were carried out in colorimetric tests in Cobas Fara equipment. In mosturation, the use of sugar adjuncts (sugarcane and high maltose syrup) presented higher primary wort content, higher mixed wort content, higher w mass and higher ort yield, representative of mosturation efficiency and starch hydrolysis rate in sugars. In the physicochemical analyses, pH was significant for the individual variables and non-significant in the interactions. There was a difference betwe en the yeasts in cell count, attenuation, and apparent extract. Glycerol and ethanol formation tended to increase along the process and acetate production was variable, with many oscillations. Glucose intake was confirmed to effectively initiate after 60 hours. Alcohol dehydrogenase activity presented higher production peaks in ale yeast cultivations, in relation to lager yeast, which did not influence the ethanol levels for the two yeasts. The best pyruvate dehydrogenase activities in ale yeast cultivation were found in the substrates maltose, sorghum and sugarcane and for lager yeast in the substrates sugarcane, high maltose syrup and rice. The highest glutamate oxaloacetate transaminase production peaks were detected in ale yeast in sugarcane juice, high maltose syrup and corn and in lager yeast in the substrates sugarcane juice, rice, and corn. Phosphofrutoquinase presented greater activities in rice substrate cultivation for both yeasts. The highest isocytrate lyase activities for ale yeast were in the substrates sugarcane juice and sorghum and for the lager yeast, in the substrates rice and high maltose syrup. The greatest diacetyl reductase activity was in sorghum substrate cultivation juice and in lager yeast, in the rice substrate. The sugar substrates presented superior extracts compared to the amylaceous substrates. No significant difference was found among the grains, with yeast amylolytic complex acting equally for the three adjuncts. All adjuncts tested are capable of producing adequate media for beer production. Ethanol production was not outstanding among the yeasts, being within the ideal range for beer production. Glycerol does not present great variations, being slightly superior in the ale yeast. Until the end of fermentation (80% of sugar consumption), acetate tended to produce more acid beer but with the likelihood of decreased acidity if fermentation evolved until the end. The substrates with different chemical constitutions influenced the enzymatic behavior in both yeasts. Alcohol dehydrogenase activity was low but it did not influence ethanol production. Piruvate dehydrogenase presented greater activities in high fermentation yeast, characterizing a possible availability of Krebs cycle intermediates. Although low, there was a difference in the isocytrate lyase activities between the two yeasts, in different substrates, clearly showing that greater activities in some substrates characterized the presence of metabolites originated from the glyoxalate cycle deviation, which can, in some situations, determine a weaker glycolytic pathway. Glutamate oxaloacetate transaminase activity is strongly related in these tests to the formation of precursors (amino acids) of substances essential to beer flavor, in which the activity is lower in less accepted samples, with the use of the hedonic scale. Phosphofrutoquinase activity was low in the two yeasts. This low activity did not influence the production of substances such as glycerol and ethanol, but production peaks in the substrates tested indicate a hi gher glycolytic activity, with potential to produce key-metabolites that can be used in other pathways. Diacetyl reductase, although presenting low activities for the two yeasts in the substrates, shows greater potentiality of reducing diacetyl in the substrates sorghum and rice. / Não foi localizado o cpf do autor.