As células da granulosa (CG) são constituintes do ambiente folicular de suma importância para o desenvolvimento, maturação e aquisição da competência oocitária, desempenhando funções como a esteroidogênese, expressão de receptores de LH (LHR) e síntese de inúmeras proteínas essenciais. Contudo, a funcionalidade e ação destas células são dependentes de alguns fatores derivados do oócito, como o GDF9 e o BMP15. A ação desses fatores, por sua vez, depende da sinalização via receptor BMPRII, já identificado em células da granulosa de mamíferos, porém com suas funções ainda pouco conhecidas na espécie bovina. O silenciamento gênico por lipofecção consiste num método de transfecção eficiente e pouco agressivo para as células, representando uma importante ferramenta para o estudo funcional de genes e proteínas celulares. O objetivo do presente trabalho foi, primeiramente, otimizar as condições de lipofecção em CG bovinas e, a partir desse protocolo, estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico para o BMPRII usando a técnica de RNA de interferência, a fim de possibilitar a futura utilização de tal estratégia como ferramenta para o estudo funcional do BMPRII e outros genes de interesse. Para tanto, no primeiro experimento referente à otimização das condições de lipofecção em CG bovinas, onde as células da granulosa, obtidas de ovários oriundos de abatedouro foram tratadas com diferentes quantidades dos lipofectores Lipofectamine® RNAiMAX (1, 2 e 3µl) ou Lipofectamine™ 2000 (1, 2 e 3µl) e dos indicadores de transfecção siGLO® (30, 50, 75 e 100nM) ou plasmídeo transgênico FUGW (100, 200, 300, 400, 600 e 900 nM) durante 24 e 48 horas de cultivo. A melhor eficiência de lipofecção foi observada às 24 horas de cultivo com 2µl de Lipofectamine™ 2000 + 100nM de siGLO®. Num segundo experimento, a partir das condições de lipofecção determinadas, foram testadas diferentes concentrações do siBMPRII (0 a 500 pmol) durante 24 h de cultivo. Ao final desse período, as células de cada grupo foram avaliadas quanto à abundância relativa mRNA BMPRII por PCR em tempo real. Todas as concentrações resultaram em uma redução semelhante de transcritos, sendo possível adotar a menor concentração (100 pM), a qual foi utilizada para determinar o tempo mínimo de cultivo necessário para obter eficiência no processo de silenciamento. As células foram tratadas por 0, 6, 12, 18 e 24 h e também avaliadas quanto aos transcritos de BMPRII. Os tempos de incubação que proporcionaram maior redução do mRNA para o BMPRII foram 18 e 24 horas. A melhor concentração e tempo de incubação com o siRNA foram avaliados por Western Blotting, confirmando a redução da expressão de BMPRII também em nível de proteína. Em conclusão, este trabalho possibilitou o estabelecimento de uma metodologia eficiente para o silenciamento gênico por lipofecção do BMPRII em CG bovinas, a qual poderá ser utilizada como ferramenta para o estudo funcional de diversos genes de interesse. / Granulosa cells (GC) are part of the folicular environment and are important for the development, maturation and acquisition of developmental competence of oocytes, performing functions such as steriodogenesis, expression of LH receptors (LHR) and synthesis of several important proteins. The function of these cells is dependent on some oocyte-derived factors, such as GDF9 and BMP15. Signaling of these factors involves the activation of the BMPRII receptor identified in granulosa cells, however, its function is not well established in bovine cells. Gene silencing is an important tool for functional studies of different cellular proteins. The aim of the present study was to develop a protocol for gene silencing using the RNA interference technique by lipofecction to knockdown BMPRII expression, for future functional studies on the role of this receptor and other genes of interest in bovine granulosa cells. For this purpose, the first experimente aimed to optimize lipofection conditions in bovine granulosa cells, collected from abbattoir ovaries and cultured in vitro. Lipofecction was tested for different concentrations of two diferent lipofection agents (1, 2 and 3 µl Lipofectamine® RNAiMAX or Lipofectamine™ 2000) and two transfection indicators (30, 50, 75 and 100nM siGLO® or 100, 200, 300, 400, 600 and 900 nM transgenic plsamid FUGW) for 24 and 48 h in culture. Best lipofection efficiency was observed at 24 h culture with 2µl Lipofectamine™ 2000 + 100nM siGLO®, which was used for the next experiment. The second experiment tested different BMPRII-siRNA concentrations (0 to 500 pM) for 24 h. At the end of culture the cells were be assessed for the relative abundance for BMPRII by real time PCR. All concentrations similarly reduced transcript abundance relative to control (0 pM). For the third experiment, the lowest effective concentration was used (100 pM) to test different culture periods with the BMPRII-siRNA and determine the minimum period to obtain transcript reduction. Cells will be treated for 0, 6, 12, 18 and 24 h and assessed for BMPRII transcripts. Greater reduction in BMPRII transcripts was observed after 18 and 24 h. The best concentration (100 pM) and time (24 h) were confirmed for knockdown of the BMPRII protein by western blotting. In conclusion, this work has provided the establishment of a reliable method for gene silencing using lipofection for the BMPRII in bovine granulosa cells, which may be used for functional studies for this gene and others of interest.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-23092014-110104 |
| Date | 21 March 2014 |
| Creators | Fernanda Cavallari de Castro |
| Contributors | Cláudia Lima Verde Leal, Heidge Fukumasu, Lígia Garcia Mesquita |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Zootecnia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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