As células da granulosa (CG) são constituintes do ambiente folicular de suma importância para o desenvolvimento, maturação e aquisição da competência oocitária, desempenhando funções como a esteroidogênese, expressão de receptores de LH (LHR) e síntese de inúmeras proteínas essenciais. Contudo, a funcionalidade e ação destas células são dependentes de alguns fatores derivados do oócito, como o GDF9 e o BMP15. A ação desses fatores, por sua vez, depende da sinalização via receptor BMPRII, já identificado em células da granulosa de mamíferos, porém com suas funções ainda pouco conhecidas na espécie bovina. O silenciamento gênico por lipofecção consiste num método de transfecção eficiente e pouco agressivo para as células, representando uma importante ferramenta para o estudo funcional de genes e proteínas celulares. O objetivo do presente trabalho foi, primeiramente, otimizar as condições de lipofecção em CG bovinas e, a partir desse protocolo, estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico para o BMPRII usando a técnica de RNA de interferência, a fim de possibilitar a futura utilização de tal estratégia como ferramenta para o estudo funcional do BMPRII e outros genes de interesse. Para tanto, no primeiro experimento referente à otimização das condições de lipofecção em CG bovinas, onde as células da granulosa, obtidas de ovários oriundos de abatedouro foram tratadas com diferentes quantidades dos lipofectores Lipofectamine® RNAiMAX (1, 2 e 3µl) ou Lipofectamine™ 2000 (1, 2 e 3µl) e dos indicadores de transfecção siGLO® (30, 50, 75 e 100nM) ou plasmídeo transgênico FUGW (100, 200, 300, 400, 600 e 900 nM) durante 24 e 48 horas de cultivo. A melhor eficiência de lipofecção foi observada às 24 horas de cultivo com 2µl de Lipofectamine™ 2000 + 100nM de siGLO®. Num segundo experimento, a partir das condições de lipofecção determinadas, foram testadas diferentes concentrações do siBMPRII (0 a 500 pmol) durante 24 h de cultivo. Ao final desse período, as células de cada grupo foram avaliadas quanto à abundância relativa mRNA BMPRII por PCR em tempo real. Todas as concentrações resultaram em uma redução semelhante de transcritos, sendo possível adotar a menor concentração (100 pM), a qual foi utilizada para determinar o tempo mínimo de cultivo necessário para obter eficiência no processo de silenciamento. As células foram tratadas por 0, 6, 12, 18 e 24 h e também avaliadas quanto aos transcritos de BMPRII. Os tempos de incubação que proporcionaram maior redução do mRNA para o BMPRII foram 18 e 24 horas. A melhor concentração e tempo de incubação com o siRNA foram avaliados por Western Blotting, confirmando a redução da expressão de BMPRII também em nível de proteína. Em conclusão, este trabalho possibilitou o estabelecimento de uma metodologia eficiente para o silenciamento gênico por lipofecção do BMPRII em CG bovinas, a qual poderá ser utilizada como ferramenta para o estudo funcional de diversos genes de interesse. / Granulosa cells (GC) are part of the folicular environment and are important for the development, maturation and acquisition of developmental competence of oocytes, performing functions such as steriodogenesis, expression of LH receptors (LHR) and synthesis of several important proteins. The function of these cells is dependent on some oocyte-derived factors, such as GDF9 and BMP15. Signaling of these factors involves the activation of the BMPRII receptor identified in granulosa cells, however, its function is not well established in bovine cells. Gene silencing is an important tool for functional studies of different cellular proteins. The aim of the present study was to develop a protocol for gene silencing using the RNA interference technique by lipofecction to knockdown BMPRII expression, for future functional studies on the role of this receptor and other genes of interest in bovine granulosa cells. For this purpose, the first experimente aimed to optimize lipofection conditions in bovine granulosa cells, collected from abbattoir ovaries and cultured in vitro. Lipofecction was tested for different concentrations of two diferent lipofection agents (1, 2 and 3 µl Lipofectamine® RNAiMAX or Lipofectamine™ 2000) and two transfection indicators (30, 50, 75 and 100nM siGLO® or 100, 200, 300, 400, 600 and 900 nM transgenic plsamid FUGW) for 24 and 48 h in culture. Best lipofection efficiency was observed at 24 h culture with 2µl Lipofectamine™ 2000 + 100nM siGLO®, which was used for the next experiment. The second experiment tested different BMPRII-siRNA concentrations (0 to 500 pM) for 24 h. At the end of culture the cells were be assessed for the relative abundance for BMPRII by real time PCR. All concentrations similarly reduced transcript abundance relative to control (0 pM). For the third experiment, the lowest effective concentration was used (100 pM) to test different culture periods with the BMPRII-siRNA and determine the minimum period to obtain transcript reduction. Cells will be treated for 0, 6, 12, 18 and 24 h and assessed for BMPRII transcripts. Greater reduction in BMPRII transcripts was observed after 18 and 24 h. The best concentration (100 pM) and time (24 h) were confirmed for knockdown of the BMPRII protein by western blotting. In conclusion, this work has provided the establishment of a reliable method for gene silencing using lipofection for the BMPRII in bovine granulosa cells, which may be used for functional studies for this gene and others of interest.

As células da granulosa (CG) são constituintes do ambiente folicular de suma importância para o desenvolvimento, maturação e aquisição da competência oocitária, desempenhando funções como a esteroidogênese, expressão de receptores de LH (LHR) e síntese de inúmeras proteínas essenciais. Contudo, a funcionalidade e ação destas células são dependentes de alguns fatores derivados do oócito, como o GDF9 e o BMP15. A ação desses fatores, por sua vez, depende da sinalização via receptor BMPRII, já identificado em células da granulosa de mamíferos, porém com suas funções ainda pouco conhecidas na espécie bovina. O silenciamento gênico por lipofecção consiste num método de transfecção eficiente e pouco agressivo para as células, representando uma importante ferramenta para o estudo funcional de genes e proteínas celulares. O objetivo do presente trabalho foi, primeiramente, otimizar as condições de lipofecção em CG bovinas e, a partir desse protocolo, estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico para o BMPRII usando a técnica de RNA de interferência, a fim de possibilitar a futura utilização de tal estratégia como ferramenta para o estudo funcional do BMPRII e outros genes de interesse. Para tanto, no primeiro experimento referente à otimização das condições de lipofecção em CG bovinas, onde as células da granulosa, obtidas de ovários oriundos de abatedouro foram tratadas com diferentes quantidades dos lipofectores Lipofectamine® RNAiMAX (1, 2 e 3µl) ou Lipofectamine™ 2000 (1, 2 e 3µl) e dos indicadores de transfecção siGLO® (30, 50, 75 e 100nM) ou plasmídeo transgênico FUGW (100, 200, 300, 400, 600 e 900 nM) durante 24 e 48 horas de cultivo. A melhor eficiência de lipofecção foi observada às 24 horas de cultivo com 2µl de Lipofectamine™ 2000 + 100nM de siGLO®. Num segundo experimento, a partir das condições de lipofecção determinadas, foram testadas diferentes concentrações do siBMPRII (0 a 500 pmol) durante 24 h de cultivo. Ao final desse período, as células de cada grupo foram avaliadas quanto à abundância relativa mRNA BMPRII por PCR em tempo real. Todas as concentrações resultaram em uma redução semelhante de transcritos, sendo possível adotar a menor concentração (100 pM), a qual foi utilizada para determinar o tempo mínimo de cultivo necessário para obter eficiência no processo de silenciamento. As células foram tratadas por 0, 6, 12, 18 e 24 h e também avaliadas quanto aos transcritos de BMPRII. Os tempos de incubação que proporcionaram maior redução do mRNA para o BMPRII foram 18 e 24 horas. A melhor concentração e tempo de incubação com o siRNA foram avaliados por Western Blotting, confirmando a redução da expressão de BMPRII também em nível de proteína. Em conclusão, este trabalho possibilitou o estabelecimento de uma metodologia eficiente para o silenciamento gênico por lipofecção do BMPRII em CG bovinas, a qual poderá ser utilizada como ferramenta para o estudo funcional de diversos genes de interesse. / Granulosa cells (GC) are part of the folicular environment and are important for the development, maturation and acquisition of developmental competence of oocytes, performing functions such as steriodogenesis, expression of LH receptors (LHR) and synthesis of several important proteins. The function of these cells is dependent on some oocyte-derived factors, such as GDF9 and BMP15. Signaling of these factors involves the activation of the BMPRII receptor identified in granulosa cells, however, its function is not well established in bovine cells. Gene silencing is an important tool for functional studies of different cellular proteins. The aim of the present study was to develop a protocol for gene silencing using the RNA interference technique by lipofecction to knockdown BMPRII expression, for future functional studies on the role of this receptor and other genes of interest in bovine granulosa cells. For this purpose, the first experimente aimed to optimize lipofection conditions in bovine granulosa cells, collected from abbattoir ovaries and cultured in vitro. Lipofecction was tested for different concentrations of two diferent lipofection agents (1, 2 and 3 µl Lipofectamine® RNAiMAX or Lipofectamine™ 2000) and two transfection indicators (30, 50, 75 and 100nM siGLO® or 100, 200, 300, 400, 600 and 900 nM transgenic plsamid FUGW) for 24 and 48 h in culture. Best lipofection efficiency was observed at 24 h culture with 2µl Lipofectamine™ 2000 + 100nM siGLO®, which was used for the next experiment. The second experiment tested different BMPRII-siRNA concentrations (0 to 500 pM) for 24 h. At the end of culture the cells were be assessed for the relative abundance for BMPRII by real time PCR. All concentrations similarly reduced transcript abundance relative to control (0 pM). For the third experiment, the lowest effective concentration was used (100 pM) to test different culture periods with the BMPRII-siRNA and determine the minimum period to obtain transcript reduction. Cells will be treated for 0, 6, 12, 18 and 24 h and assessed for BMPRII transcripts. Greater reduction in BMPRII transcripts was observed after 18 and 24 h. The best concentration (100 pM) and time (24 h) were confirmed for knockdown of the BMPRII protein by western blotting. In conclusion, this work has provided the establishment of a reliable method for gene silencing using lipofection for the BMPRII in bovine granulosa cells, which may be used for functional studies for this gene and others of interest.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The role of local factors in follicular selection in mammals is not fully understood. The aim of the present study was to identify local factors, receptors and intracellular signaling pathways involved in bovine dominant follicle selection and subordinate follicles atresia. In the first study, the pattern of mRNA expression and function of FGF10 and its receptor FGFR2b was evaluated during bovine follicle deviation. FGF10 and FGFR2b were significantly more expressed in theca and granulosa cells retrieved from subordinate follicles, respectively. Intrafollicular FGF10 treatment in the larger follicle dose-dependently inhibited follicle growth and significantly reduced estradiol secretion. In granulosa cells, FGF10 treatment decreased CYP19A1 and cyclin D2 mRNA expression whereas FGFR2b tended to be more expressed after treatment. In theca cells, a significant increase in FGF10 expression was observed in FGF10-treated follicles. In a second study, BMPRs, BMP15 and GDF9 expression was evaluated in cows ovariectomized when the size of the largest and second largest follicle did not have a significant difference (D2), had slight difference (D3) or marked difference (D4). At day 2 of follicular wave, it was observed a significant increase in BMPR1A expression whereas BMPR-2 and - 1B tended to be more expressed in future subordinate follicles. At day 3, when dominant and subordinate follicles are reliably identified, BMPR-2 and 1B were more expressed in subordinate follicles. At day 4, BMPR1B (mRNA and protein) was significantly more expressed in granulosa cells from atretic follicles. The increased BMPR1B expression during atresia was confirmed in granulosa cells from follicles induced to atresia with FGF10 or estradiol receptor antagonist treatment. Similar levels of BMP15 and GDF9 proteins were observed in follicular fluid from dominant and subordinate follicles. In a third study, we aimed to identify intracellular signaling pathways differentially activated in granulosa cells during deviation. Phosphorylated MAPK was more abundant in the future dominant follicle, but did not differ between follicles at the expected moment and after follicular deviation. Subordinate follicles phosphorylated STAT3 levels tended to increase at day 3 and were significantly greater at day 4 in comparison to dominant follicles. In conclusion, present results suggest that decreased FGF10 and FGFR2b expression allows dominant follicle growth and differentiation whereas increased FGF10 signaling in the subordinate follicle induces atresia. The patterns of BMPR- 2, -1B and -1A indicate that these receptors play roles during follicle deviation. Phosphorylated MAPK abundance is an early marker of follicle dominance, but is not differentially regulated during and after deviation. The functional status of STAT3 suggests that this pathway is involved in granulosa cell death. / O controle local da seleção folicular em mamíferos ainda é pouco compreendido. O objetivo do presente estudo foi identificar fatores locais, receptores e rotas de sinalização envolvidas na seleção do folículo dominante e atresia dos subordinados em bovinos. Em um primeiro estudo, avaliou-se a regulação e função do FGF10 e do seu receptor FGFR2b durante a divergência folicular. A expressão de FGF10 e FGFR2b foi significativamente maior nas células da teca e granulosa, respectivamente, provenientes dos folículos subordinados. A injeção intrafolicular de FGF10 inibiu o crescimento folicular de maneira dose dependente e reduziu significativamente a síntese de estradiol. Nas células da granulosa, a injeção de FGF10 diminuiu a expressão de RNAm de CYP19A1 e ciclina D2, enquanto que uma tendência de aumento da expressão do receptor FGFR2b foi observada. Nas células da teca, um aumento significativo na expressão de FGF10 foi observado nos folículos tratados com FGF10. Em um segundo estudo, o padrão de expressão dos receptores de BMPs e das proteínas BMP15 e GDF9 foram avaliados em vacas ovariectomizadas em diferenes dias em relação ao inicio da onda folicular, comparando os dois maiores folículos antes (dia 2), durante (dia 3) ou após a divergência folícular (dia 4). No dia 2 da onda folicular, foi observada maior expressão do receptor BMPR-1A e tendências a maior expressão dos receptores BMPR-2 e -1B nos futuros folículos subordinados. No dia 3, quando os folículos dominantes e subordinados são identificados, a expressão de BMPR-1B e -2 foi maior nos folículos subordinados. No dia 4, o receptor BMPR1B (RNAm e proteína) foi significativamente mais expresso nas células da granulosa de folículos atrésicos. O aumento da expressão do BMPR1B durante a atresia folicular foi confirmado nas células da granulosa de folículos induzidos à atresia através do tratamento com FGF10 ou inibidor dos receptores de estradiol. A abundância de BMP15 e GDF9 no fluído folicular não diferiu entre folículos dominantes e subordinados. Em um terceiro estudo, buscou-se identificar rotas de sinalização diferentemente ativas nas células da granulosa durante a divergência. Os níveis de MAPK fosforilada foram significativamente superiores nos futuros folículos dominantes (dia 2), mas não diferiram entre os dois maiores folículos durante ou após a divergência. Folículos subordinados apresentaram maiores níveis de STAT3 fosforilada em relação aos seus respectivos dominantes em todos os pares de folículos coletados, sendo observado um aumento significativo em folículos atrésicos coletados no dia 4. Em conclusão, os resultados sugerem que a expressão reduzida de FGF10 e do receptor FGFR2b possibilitam o crescimento e diferenciação do folículo dominante, enquanto que o aumento da sinalização do FGF10 no folículo subordinado está associado com a atresia. O perfil de expressão dos receptores BMPR-2, -1B e -1A indica que os mesmos apresentam funções na regulação da divergência folicular em bovinos. A fosforilação da MAPK é um marcador inicial de dominância folicular, mas não é diferentemente regulada durante e após a divergência, enquanto que o padrão de ativação da STAT3 sugere que essa via está envolvida na morte das células da granulosa.

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Desta forma, o presente estudo teve por objetivo avançar no entendimento da função e regulação de fatores locais no ovário bovino, avaliando a função do fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9) no crescimento folicular final. Além disso, objetivou-se caracterizar a expressão de membros da família TGF-β, em especial as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e seus receptores, na luteinização e ovulação em bovinos. Em um primeiro experimento, a injeção intrafolicular de GDF9 em folículos dominantes (9±0,2 mm de diâmetro), nas concentrações finais de 100 ou 1000 ng/mL, não teve efeito sobre o crescimento folicular final, estro e ovulação (P>0,05). No segundo estudo, utilizando células da granulosa provenientes de folículos pré-ovulatórios (>12 mm), coletados in vivo em diferentes momentos (0, 3, 6, 12 e 24 h) após aplicação i.m de GnRH, a expressão de RNAm das BMPs 1 e 4 não foi regulada. Por outro lado, a expressão de BMP2 aumentou significativamente 3 e 6 h após GnRH (P<0,05). A expressão dos receptores BMPR2 e TGFBR1 aumentou significativamente 12 h após tratamento, enquanto que os receptores BMPR-1A e -1B foram mais expressos 0 e 12 h após GnRH. Os níveis de progesterona no fluído folicular decresceram linearmente com o aumento da expressão de BMPR-1A (R2=0,49) e -1B (R2=0,5). O aumento na expressão de TGFBR1 determinou uma diminuição quadrática nos níveis de progesterona (R2=0,45). O aumento na expressão de BMP2 (R2=0,4) e BMPR1A (R2=0,28) determinou um aumento na concentração de estradiol, apresentando efeito linear e quadrático, respectivamente. Por outro lado, os níveis de estrógeno decresceram linearmente com o aumento na expressão de BMPR2 (R2=0,31). Os dados sugerem que a elevação nos níveis de GDF9 em folículos diferenciados não altera o destino dos mesmos. A expressão da BMP2 está associada a maiores níveis de estradiol, enquanto que a expressão dos receptores de BMPs sugere uma inibição no processo de luteinização. A elucidação do papel dos fatores locais na fisiologia ovariana contribui com o entendimento de patologias reprodutivas e desenvolvimento de tecnologias com fins de contracepção ou aumento da taxa ovulatória. / Antral follicle development culminates with ovulation and, in monovulatory species, only one follicle is selected to grow whereas all the others undergo atresia. During these processes, all the follicles are under the same endocrine environment, indicating the participation of locally produced factors in the regulation of follicular growth and differentiation. In this context, the involvement of transforming growth factors-beta (TGF-β) family members and their receptors is highlighted. Despite their high relevance, the real functions of TGF-β proteins in ovarian physiology is still poorly understood. In this regard, the aim of this study was to gain insight into the function and regulation of ovarian factors, investigating the function of growth and differentiation factor 9 (GDF9) during dominant follicle growth. Furthermore, we tested the hypothesis that TGF-β members, especially bone morphogenetic proteins (BMPs) and their receptors are regulated during luteinization and ovulation processes in cattle. In a first experiment, the intrafollicular injection of GDF9 in dominant follicles (9±0.2 mm diameter) at final concentrations of 100 and 1000ng/mL did not affect follicular growth, estrus manifestation and ovulation (P>0.05). In a second study, using granulosa cells from preovulatory follicles (>12mm), collected in vivo at different time-points (0, 3, 6, 12 and 24 h) after GnRH treatment, mRNA expression of BMPs 1 and 4 was not regulated. By the other size, BMP2 expression was significantly upregulated at 3 and 6 h (P<0.05). The mRNA expression of BMPR2 and TGFBR1 increased 12 h after GnRH treatment (P<0.05), whereas the receptors BMPR-1A and -1B were more expressed at the moment (0 h) and 12 h after GnRH injection. Follicular fluid progesterone concentrations decreased linearly with increased BMPR-1A (R2=0.49) and -1B (R2=0.5) mRNA expression. The increase in TGFBR1 had a negative quadratic effect on progesterone concentration (R2=0.45). The increase in BMP2 (R2=0.4) and BMPR1A (R2=0.28) determined an increase in estradiol, having linear and quadratic effects, respectively. By the other side, follicular fluid estradiol concentrations decreased linearly with increased BMPR2 (R2=0.31) expression. Collectively, the results suggest that increasing the levels of GDF9 in differentiated follicles does not affect their fate. BMP2 expression is associates to high levels of estradiol in follicular fluid, whereas BMPRs expression suggests an inhibitory effect on luteinization. Elucidating the functions of local factors in ovarian physiology would allow to better understand pathological processes and the development of technologies for contraception or, paradoxally, to increase ovulation rates.

Introdução: Considerando a prevalência, a importância social dos tratamentos de alta complexidade de mulheres inférteis e o contexto atual da literatura que atribui relevância aos polimorfismos dos genes reguladores do desenvolvimento inicial e crescimento folicular, entre eles o FSHR, LH, LHR, AMH, AMHR, BMP15 e GDF9; torna-se imprescindível o melhor conhecimento e a quantificação desses fatores. Com isso poderemos individualizar e abordar de forma mais racional a investigação e o tratamento destas mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Objetivos: Avaliar se os polimorfismos dos genes do LH (Trp8Arg e Ile15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 (673C/T, 9C/G, IVSI+905A/G), GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>T e 646G>A), e dos receptores do FSH (Ser680Asn), do LH (18isnILQ) e do AMH (Ile49Ser), estão relacionados a diferentes desfechos reprodutivos em pacientes submetidas à fertilização in vitro. Métodos: Realizamos dois estudos em mulheres submetidas à indução ovulatória para FIV: (1) um estudo caso-controle entre pacientes normo respondedoras e má respondedoras, (2) um estudo transversal em pacientes jovens submetidas à indução ovulatória para fertilização in vitro (FIV). Foi extraído DNA das pacientes submetidas à indução ovulatória para FIV a partir do sangue periférico para realização de polymerase chain reaction, com o objetivo de detectar os polimorfismos dos referidos genes e as respectivas relações com os resultados obtidos na estimulação ovariana, no Laboratório de Terapia Gênica do HCPA/UFRGS. Resultados: Foi evidenciado que a presença do polimorfismo 398C>G no gene GDF9 está associada à má resposta em pacientes inférteis submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro (68% em má respondedoras versus 23% normo respondedoras, OR: 4.01, 95% IC:1.52-10.60). Além disso, o genótipo mutante para o polimorfismo G447C>T no gene do GDF9 foi encontrado em 50% nas pacientes má respondedoras versus 19% nas pacientes normo respondedoras (OR: 2.88, 95% IC:1.19-6.04), evidenciando uma forte associação destes polimorfismos com a má resposta ovariana à estimulação. Encontramos, também, que as mulheres portadoras do alelo mutante do gene 447C>T do GDF9 tiveram um número menor de folículos entre 12-14 mm no dia do hCG (1,62 versus 2,46, P = 0,007). As mulheres com o alelo mutante do gene do GDF9 398C>G tiveram um menor número de folículos maiores que 17 mm no dia do hCG (4,33 versus 6,49, P = 0,001), menor número de folículos entre 12 e 14 milímetros no dia do hCG (1,42 versus 2,25, P= 0,017), um menor número de folículos no dia do hCG (7,33 versus 10,11 versus, P = 0,007), e redução total de oócitos MII coletados (5,38 versus 8,84 P = 0,017). Conclusão: Concluímos que polimorfismos no gene do GDF9 têm uma influência significativa no desenvolvimento do oócito, uma vez que a presença dos alelos mutantes 447C>T e 398C>G diminui o número total de folículos maduros e o número total de oócitos coletados de tais pacientes, além deste último estar associado à má resposta ovariana em pacientes submetidas à indução da ovulação para fertilização in vitro. Isso mostra que este membro da família TGFβ além de atuar nas fases iniciais da foliculogênese também tem influência importante sobre a fase final do desenvolvimento do oócito. / Introduction: Given the prevalence, the social importance of high complexity treatments of infertile women and the current context of the literature assigns relevance to polymorphisms of genes regulating early follicle growth and development, including LH, AMH, BMP15, GDF9, FSHR, LHR and AMHR; become essential to better understanding and quantification of these factors. With this we can individualize and address more rationally research and treatment of these women undergoing IVF. Objectives: Evaluate the relationship of polymorphisms of LH (Trp8Arg andIle15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 ( 673C/T, 9C/ G, IVSI+905A/ G) and GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>Tand646G>A) genes, and FSH (Ser680Asn), LH (18isnILQ) and AMH (Ile49Ser) receptors genes, related to different reproductive outcomes in patients undergoing IVF. Methods: Our study consisted of two phases: the first conducted a case-control study among patients with normal responders and poor responders, and the second a cross-sectional study in young patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. DNA was extracted from peripheral blood for performing polymerase chain reaction (PCR) and analyzed at the Laboratory of Gene Therapy HCPA/UFRGS, with the objective of detecting polymorphisms of these genes and their relationships to the results obtained in ovarian stimulation. Results: It was shown that the presence of polymorphism 398C>G in GDF9 gene is associated with poor response in infertile patients undergoing controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization (68% in poor responders versus 23% in normal responders). Furthermore, the genotype GDF9 447C>T mutant polymorphism was found in 50% and 19%, respectively, in poor and normal responders patients, showing a strong association with this polymorphism and a poor response in ovarian stimulation. Women carrying the GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles between 12-14 mm on the day of r-hCG (1.62 vs. 2.46, respectively P=0.007). Women with GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles larger than 17 mm on the r-hCG day (4.33 vs. 6.49, P=0.001), a smaller number of follicles between 12 and 14mm on the r-hCG day (1.42 vs. 2.25, P=0.017), a smaller number of follicles on the r-hCG day (7.33 vs. 10.11, P=0,007), and a reduced overall number of MII oocytes collected (5.38 vs. 8.84 ,P=0.017). Conclusion: We conclude that GDF9 polymorphisms in the gene have a significant influence on the development of the oocytes, since the presence of the mutant alleles 447C>T and 398C>G decreases the total number of mature follicles, total number of oocytes collected, and are associated a poor ovarian response in patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. This shows that this member of the TGFβ family besides acting in the early stages of folliculogenesis also has important influence on the final stage of oocytes development.

Introdução: Considerando a prevalência, a importância social dos tratamentos de alta complexidade de mulheres inférteis e o contexto atual da literatura que atribui relevância aos polimorfismos dos genes reguladores do desenvolvimento inicial e crescimento folicular, entre eles o FSHR, LH, LHR, AMH, AMHR, BMP15 e GDF9; torna-se imprescindível o melhor conhecimento e a quantificação desses fatores. Com isso poderemos individualizar e abordar de forma mais racional a investigação e o tratamento destas mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Objetivos: Avaliar se os polimorfismos dos genes do LH (Trp8Arg e Ile15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 (673C/T, 9C/G, IVSI+905A/G), GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>T e 646G>A), e dos receptores do FSH (Ser680Asn), do LH (18isnILQ) e do AMH (Ile49Ser), estão relacionados a diferentes desfechos reprodutivos em pacientes submetidas à fertilização in vitro. Métodos: Realizamos dois estudos em mulheres submetidas à indução ovulatória para FIV: (1) um estudo caso-controle entre pacientes normo respondedoras e má respondedoras, (2) um estudo transversal em pacientes jovens submetidas à indução ovulatória para fertilização in vitro (FIV). Foi extraído DNA das pacientes submetidas à indução ovulatória para FIV a partir do sangue periférico para realização de polymerase chain reaction, com o objetivo de detectar os polimorfismos dos referidos genes e as respectivas relações com os resultados obtidos na estimulação ovariana, no Laboratório de Terapia Gênica do HCPA/UFRGS. Resultados: Foi evidenciado que a presença do polimorfismo 398C>G no gene GDF9 está associada à má resposta em pacientes inférteis submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro (68% em má respondedoras versus 23% normo respondedoras, OR: 4.01, 95% IC:1.52-10.60). Além disso, o genótipo mutante para o polimorfismo G447C>T no gene do GDF9 foi encontrado em 50% nas pacientes má respondedoras versus 19% nas pacientes normo respondedoras (OR: 2.88, 95% IC:1.19-6.04), evidenciando uma forte associação destes polimorfismos com a má resposta ovariana à estimulação. Encontramos, também, que as mulheres portadoras do alelo mutante do gene 447C>T do GDF9 tiveram um número menor de folículos entre 12-14 mm no dia do hCG (1,62 versus 2,46, P = 0,007). As mulheres com o alelo mutante do gene do GDF9 398C>G tiveram um menor número de folículos maiores que 17 mm no dia do hCG (4,33 versus 6,49, P = 0,001), menor número de folículos entre 12 e 14 milímetros no dia do hCG (1,42 versus 2,25, P= 0,017), um menor número de folículos no dia do hCG (7,33 versus 10,11 versus, P = 0,007), e redução total de oócitos MII coletados (5,38 versus 8,84 P = 0,017). Conclusão: Concluímos que polimorfismos no gene do GDF9 têm uma influência significativa no desenvolvimento do oócito, uma vez que a presença dos alelos mutantes 447C>T e 398C>G diminui o número total de folículos maduros e o número total de oócitos coletados de tais pacientes, além deste último estar associado à má resposta ovariana em pacientes submetidas à indução da ovulação para fertilização in vitro. Isso mostra que este membro da família TGFβ além de atuar nas fases iniciais da foliculogênese também tem influência importante sobre a fase final do desenvolvimento do oócito. / Introduction: Given the prevalence, the social importance of high complexity treatments of infertile women and the current context of the literature assigns relevance to polymorphisms of genes regulating early follicle growth and development, including LH, AMH, BMP15, GDF9, FSHR, LHR and AMHR; become essential to better understanding and quantification of these factors. With this we can individualize and address more rationally research and treatment of these women undergoing IVF. Objectives: Evaluate the relationship of polymorphisms of LH (Trp8Arg andIle15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 ( 673C/T, 9C/ G, IVSI+905A/ G) and GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>Tand646G>A) genes, and FSH (Ser680Asn), LH (18isnILQ) and AMH (Ile49Ser) receptors genes, related to different reproductive outcomes in patients undergoing IVF. Methods: Our study consisted of two phases: the first conducted a case-control study among patients with normal responders and poor responders, and the second a cross-sectional study in young patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. DNA was extracted from peripheral blood for performing polymerase chain reaction (PCR) and analyzed at the Laboratory of Gene Therapy HCPA/UFRGS, with the objective of detecting polymorphisms of these genes and their relationships to the results obtained in ovarian stimulation. Results: It was shown that the presence of polymorphism 398C>G in GDF9 gene is associated with poor response in infertile patients undergoing controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization (68% in poor responders versus 23% in normal responders). Furthermore, the genotype GDF9 447C>T mutant polymorphism was found in 50% and 19%, respectively, in poor and normal responders patients, showing a strong association with this polymorphism and a poor response in ovarian stimulation. Women carrying the GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles between 12-14 mm on the day of r-hCG (1.62 vs. 2.46, respectively P=0.007). Women with GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles larger than 17 mm on the r-hCG day (4.33 vs. 6.49, P=0.001), a smaller number of follicles between 12 and 14mm on the r-hCG day (1.42 vs. 2.25, P=0.017), a smaller number of follicles on the r-hCG day (7.33 vs. 10.11, P=0,007), and a reduced overall number of MII oocytes collected (5.38 vs. 8.84 ,P=0.017). Conclusion: We conclude that GDF9 polymorphisms in the gene have a significant influence on the development of the oocytes, since the presence of the mutant alleles 447C>T and 398C>G decreases the total number of mature follicles, total number of oocytes collected, and are associated a poor ovarian response in patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. This shows that this member of the TGFβ family besides acting in the early stages of folliculogenesis also has important influence on the final stage of oocytes development.

Introdução: Considerando a prevalência, a importância social dos tratamentos de alta complexidade de mulheres inférteis e o contexto atual da literatura que atribui relevância aos polimorfismos dos genes reguladores do desenvolvimento inicial e crescimento folicular, entre eles o FSHR, LH, LHR, AMH, AMHR, BMP15 e GDF9; torna-se imprescindível o melhor conhecimento e a quantificação desses fatores. Com isso poderemos individualizar e abordar de forma mais racional a investigação e o tratamento destas mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Objetivos: Avaliar se os polimorfismos dos genes do LH (Trp8Arg e Ile15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 (673C/T, 9C/G, IVSI+905A/G), GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>T e 646G>A), e dos receptores do FSH (Ser680Asn), do LH (18isnILQ) e do AMH (Ile49Ser), estão relacionados a diferentes desfechos reprodutivos em pacientes submetidas à fertilização in vitro. Métodos: Realizamos dois estudos em mulheres submetidas à indução ovulatória para FIV: (1) um estudo caso-controle entre pacientes normo respondedoras e má respondedoras, (2) um estudo transversal em pacientes jovens submetidas à indução ovulatória para fertilização in vitro (FIV). Foi extraído DNA das pacientes submetidas à indução ovulatória para FIV a partir do sangue periférico para realização de polymerase chain reaction, com o objetivo de detectar os polimorfismos dos referidos genes e as respectivas relações com os resultados obtidos na estimulação ovariana, no Laboratório de Terapia Gênica do HCPA/UFRGS. Resultados: Foi evidenciado que a presença do polimorfismo 398C>G no gene GDF9 está associada à má resposta em pacientes inférteis submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro (68% em má respondedoras versus 23% normo respondedoras, OR: 4.01, 95% IC:1.52-10.60). Além disso, o genótipo mutante para o polimorfismo G447C>T no gene do GDF9 foi encontrado em 50% nas pacientes má respondedoras versus 19% nas pacientes normo respondedoras (OR: 2.88, 95% IC:1.19-6.04), evidenciando uma forte associação destes polimorfismos com a má resposta ovariana à estimulação. Encontramos, também, que as mulheres portadoras do alelo mutante do gene 447C>T do GDF9 tiveram um número menor de folículos entre 12-14 mm no dia do hCG (1,62 versus 2,46, P = 0,007). As mulheres com o alelo mutante do gene do GDF9 398C>G tiveram um menor número de folículos maiores que 17 mm no dia do hCG (4,33 versus 6,49, P = 0,001), menor número de folículos entre 12 e 14 milímetros no dia do hCG (1,42 versus 2,25, P= 0,017), um menor número de folículos no dia do hCG (7,33 versus 10,11 versus, P = 0,007), e redução total de oócitos MII coletados (5,38 versus 8,84 P = 0,017). Conclusão: Concluímos que polimorfismos no gene do GDF9 têm uma influência significativa no desenvolvimento do oócito, uma vez que a presença dos alelos mutantes 447C>T e 398C>G diminui o número total de folículos maduros e o número total de oócitos coletados de tais pacientes, além deste último estar associado à má resposta ovariana em pacientes submetidas à indução da ovulação para fertilização in vitro. Isso mostra que este membro da família TGFβ além de atuar nas fases iniciais da foliculogênese também tem influência importante sobre a fase final do desenvolvimento do oócito. / Introduction: Given the prevalence, the social importance of high complexity treatments of infertile women and the current context of the literature assigns relevance to polymorphisms of genes regulating early follicle growth and development, including LH, AMH, BMP15, GDF9, FSHR, LHR and AMHR; become essential to better understanding and quantification of these factors. With this we can individualize and address more rationally research and treatment of these women undergoing IVF. Objectives: Evaluate the relationship of polymorphisms of LH (Trp8Arg andIle15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 ( 673C/T, 9C/ G, IVSI+905A/ G) and GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>Tand646G>A) genes, and FSH (Ser680Asn), LH (18isnILQ) and AMH (Ile49Ser) receptors genes, related to different reproductive outcomes in patients undergoing IVF. Methods: Our study consisted of two phases: the first conducted a case-control study among patients with normal responders and poor responders, and the second a cross-sectional study in young patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. DNA was extracted from peripheral blood for performing polymerase chain reaction (PCR) and analyzed at the Laboratory of Gene Therapy HCPA/UFRGS, with the objective of detecting polymorphisms of these genes and their relationships to the results obtained in ovarian stimulation. Results: It was shown that the presence of polymorphism 398C>G in GDF9 gene is associated with poor response in infertile patients undergoing controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization (68% in poor responders versus 23% in normal responders). Furthermore, the genotype GDF9 447C>T mutant polymorphism was found in 50% and 19%, respectively, in poor and normal responders patients, showing a strong association with this polymorphism and a poor response in ovarian stimulation. Women carrying the GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles between 12-14 mm on the day of r-hCG (1.62 vs. 2.46, respectively P=0.007). Women with GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles larger than 17 mm on the r-hCG day (4.33 vs. 6.49, P=0.001), a smaller number of follicles between 12 and 14mm on the r-hCG day (1.42 vs. 2.25, P=0.017), a smaller number of follicles on the r-hCG day (7.33 vs. 10.11, P=0,007), and a reduced overall number of MII oocytes collected (5.38 vs. 8.84 ,P=0.017). Conclusion: We conclude that GDF9 polymorphisms in the gene have a significant influence on the development of the oocytes, since the presence of the mutant alleles 447C>T and 398C>G decreases the total number of mature follicles, total number of oocytes collected, and are associated a poor ovarian response in patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. This shows that this member of the TGFβ family besides acting in the early stages of folliculogenesis also has important influence on the final stage of oocytes development.