In dieser Arbeit wurden ungesättigte Vinyl- und Ethynylphosphonothiolate hergestellt und als Linker für Cystein-selektive Proteinmodifikationen verwendet. Zunächst wurde, ausgehend von ungesättigten Phosphoniten und elektrophilen Disulfiden als Startmaterialien, eine Syntheseroute zur Herstellung von ungesättigten Phosphonothiolaten entwickelt. Die hohe Chemoselektivität dieser Reaktion ermöglichte die Einführung von Vinylphosphonothiolaten auf ungeschützten Modellpeptiden und dem Protein Ubiquitin. Es konnte gezeigt werden, dass ungesättigte Phosphonothiolate unter neutralen bis leicht basischen Bedingungen selektiv mit Thiolen reagieren und sich daher als Linker für Cystein-selektive Proteinmodifikationen eignen. Die Vielseitigkeit der hier entwickelten Biokonjugationsmethode wurde in drei Anwendungen demonstriert. Ausgehend von dem Vinylphoshonothiolat-modifizierten Ubiquitin konnten homogene Ubiquitin-Protein-Konjugate erzeugt werden; zum einen ein nicht hydrolysierbares Diubiquitin-Konjugat und zum anderen ein Ubiquitin-α–Synuclein-Konjugat. Des Weiteren wurden ungesättigte Phosphonothiolate als Linker in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten getestet. Hier zeigte sich, dass insbesondere Vinylphosphonothiolat-Linker Potential zur Herstellung von stabilen Antikörper-Konjugaten aufweisen. Schließlich wurden Vinylphosphonothiolate als Linker verwendet, um sowohl Chaperon-bindende Antikörper als auch Deubiquitinasen (DUBs) mit photoreaktiven Crosslinkern auszustatten um damit dynamische Protein-Interaktionen zu untersuchen.
Insgesamt ermöglicht das hier entwickelte Verfahren die chemoselektive Umwandlung von elektrophilen Disulfiden in elektrophile Vinyl- und Ethynylphosphonothiolate, wodurch Reaktivität für eine Thioladdition induziert wird. Dadurch können zwei komplexe, thiolhaltige Moleküle selektiv konjugiert werden, was insbesondere für die Herstellung von homogen modifizierten Peptid- und Proteinkonjugaten von Bedeutung ist. / In this work, unsaturated vinyl- and ethynylphosphonothiolates were synthesised and used as linkers for cysteine-selective protein modifications. First, a synthetic route for the generation of unsaturated phosphonothiolates was developed, using unsaturated phosphonites and electrophilic disulfides as starting materials. The high chemoselectivity of this reaction enabled the introduction of vinylphosphonothiolates on unprotected model peptides and the protein ubiquitin. It could then be shown that unsaturated phosphonothiolates react selectively with thiols under neutral to slightly basic conditions and are therefore suitable as linkers for cysteine-selective protein modifications. The versatility of the herein developed bioconjugation method was demonstrated in three applications. First, starting from the vinylphosphonothiolate-modified ubiquitin, homogeneous ubiquitin-protein conjugates could be generated, in particular a non-hydrolyzable diubiquitin conjugate and a ubiquitin-α-synuclein conjugate. Second, the suitability of unsaturated phosphonothiolates as linkers for the generation of stable antibody-drug conjugates was tested. Vinylphosphonothiolate linkers thereby showed potential to produce stable antibody conjugates. Finally, vinylphosphonothiolates were used as linkers to conjugate both chaperone-binding antibodies and deubiquitinases (DUBs) to photo-reactive crosslinkers in order to investigate dynamic protein interactions.
Overall, the herein developed methodology enables the chemoselective conversion of electrophilic disulfides into electrophilic vinyl- and ethynylphosphonothiolates, which in turn react selectively with thiols. As a result, two complex, thiol-containing molecules can be selectively conjugated, which is particularly important for the production of homogeneously modified peptide and protein conjugates.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/22864 |
| Date | 14 December 2020 |
| Creators | Baumann, Alice Leonie |
| Contributors | Hackenberger, Christian P. R., Fox, Joseph M., Arenz, Christoph |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-ND 4.0) Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
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