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Previous issue date: 2018-01-30 / A doença de Alzheimer (DA) afeta cerca de 46,8 milhões de pessoas no mundo, e é
caracterizada pelo declínio progressivo da função cognitiva, em especial da memória
episódica. É multifatorial, e o acúmulo de peptídeos β-amiloides (Aβ) é considerado o
principal mecanismo da neurodegeneração subjacente à doença. Os Aβ são os principais
componentes das placas amilóides, um dos marcos fisiopatológicos no encéfalo dos
pacientes. A infusão intracerebral de Aβ em ratos é um modelo animal de DA muito
utilizado, produzindo seu acúmulo em regiões cerebrais afetadas, como o hipocampo e o
neocórtex e, produzindo déficits cognitivos compatíveis com os sintomas, como déficits
na memória espacial. Porém, a maioria dos estudos evidencia déficits equivalentes aos
estágios moderado e avançado da DA após a infusão prolongada de Aβ, sem avaliar
déficits sutis de estágios iniciais. Isso seria relevante para compreensão dos mecanismos
fisiopatológicos e para o teste de possíveis tratamentos neuroprotetores. Uma tarefa
utilizada para avaliar déficits relacionados à disfunção hipocampal em ratos é o labirinto
de Barnes. Os animais são expostos a uma plataforma circular, com buracos ao redor,
sendo apenas um deles conectado a um esconderijo. Nessa tarefa, os animais guiam-se
por pistas distais para encontrar o local seguro. O desempenho é avaliado por parâmetros,
como latência e distância até o alvo, número de visitas a buracos errados, dentre outros,
e por uma análise específica de estratégias de busca usadas para atingir o alvo. O animal
pode se localizar pelas pistas distais (dispostas ao redor do labirinto), utilizando
informação espacial (estratégia direta) ou outros tipos de busca, visitando de maneira
aleatória ou seriada buracos do aparato (estratégias não diretas). Essa avaliação permite a
detecção de alterações no modo de solução da tarefa. No presente trabalho, objetivamos
investigar sinais cognitivos iniciais da DA em ratos Wistar submetidos à infusão
intracerebral de Aβ, e os efeitos de um potencial tratamento neuroprotetor, por meio da
avaliação da memória espacial no labirinto de Barnes. Utilizamos o extrato alcalóide de
Erythrina velutina (“mulungu”), cujos componentes mostram ações ansiolíticas, antiinflamatórias,
antioxidantes e pró-colinérgicas. Na 1ª etapa, padronizamos a tarefa de
Barnes para as nossas condições experimentais, e verificamos se há influência da
repetição de exposições ao labirinto (importante para verificação de progressão de sinais
cognitivos) ou da implantação das cânulas intracerebrais no desempenho dos animais.
Animais que passaram ou não pela cirurgia para implantação de cânulas (bilateralmente
na sub-região hipocampal CA1 e no ventrículo lateral) passaram por 5 sequências de
exposição ao labirinto de Barnes (4 treinos com 4 trials cada, um teste após 24h e um
teste após 10 dias). Os resultados mostraram que houve aprendizado e evocação da tarefa.
Concluímos que a tarefa pode ser realizada repetidamente, e em animais com implantes
cerebrais de cânulas, sem prejuízo de desempenho. Na segunda etapa, investigamos o uso
de diferentes estratégias no labirinto de Barnes na presença ou ausência de pistas distais.
Ratos foram expostos aos treinos no labirinto de Barnes, e no teste (24h após) parte dos
animais foi exposta ao labirinto na presença de pistas distais (condição ‘espacial’) e a
outra parte passou pelo teste com uma cortina preta em volta do labirinto (condição ‘nãoespacial’).
Ambos os grupos aprenderam e evocaram a tarefa, entretanto os animais
expostos às pistas distais preferiram o uso de estratégia direta, enquanto o grupo nãoespacial
preferiu outras estratégias. Concluímos que a retirada de pistas distais não
impede que os animais encontrem o alvo, e para isso utilizam estratégias de busca
alternativas ao uso de informação espacial. Na terceira etapa (2 experimentos)
verificamos os efeitos da infusão intracerebral de peptídeos Aβ sobre o aprendizado e a
memória no labirinto de Barnes. No experimento 1, ratos receberam 15 infusões diárias de salina ou Aβ (30, 100 ou 300 pmol) i.c.v., sendo que no 1º dia de tratamento houve
infusões em CA1. Foram submetidos a 3 sequências de exposição ao Barnes (treinos,
teste 24h e reteste 10 dias). A sequência I foi realizada antes da cirurgia (na qual ocorreu
o aprendizado para todos os animais), a II a partir da 11ª infusão, e a III 10 dias depois.
Nas sequências II e III, houve grande variação do comportamento dos animais Aβ, de
modo que não foram observadas diferenças entre os grupos, além de uma alta mortalidade
dos animais. Ao fim dos experimentos comportamentais, os animais foram eutanasiados
e submetidos à imunohistoquímica para Aβ, cuja análise por densitometria ótica relativa
mostrou aumento de sua marcação no hipocampo e neocórtex. No 2º experimento
verificamos os efeitos da infusão de Aβ sobre o desempenho geral e estratégias de busca
no labirinto de Barnes, com algumas alterações no protocolo de infusão e execução da
tarefa. Os animais (salina ou Aβ 30 pmol) foram submetidos a uma sequência de
exposição ao Barnes com 4 treinos de 2 trials cada e um teste realizado 3 dias depois,
visando dificultar a tarefa. Não houve diferenças entre os grupos no aprendizado. No
teste, embora os animais Aβ mostrassem alguma evocação, estes utilizaram
preferencialmente estratégias aleatória e seriada, enquanto o grupo salina preferiu a
estratégia direta. Concluímos que a infusão de Aβ promoveu alterações sutis na memória
espacial compatíveis com a manifestação inicial da DA, indicando relevância para
investigações mecanicísticas e terapêuticas em estágios precoces da doença. Na última
etapa, animais submetidos ao mesmo tratamento de infusão com Aβ (30 pmol) foram
tratados concomitantemente com 200 mg/kg do extrato de mulungu por via oral. Os
grupos (salina, Amulungu e Amulungu) foram submetidos a 2 sequências de
Barnes (a partir da 11ª infusão e dez dias depois). De forma geral, não foram observadas
diferenças entre os grupos nos parâmetros referentes ao aprendizado ou à evocação da
tarefa. Sendo assim, concluímos que o protocolo utilizado não foi capaz de detectar um
efeito benéfico do extrato de mulungu no modelo de DA por infusão de peptídeos Aβ. / Alzheimer’s disease (AD) is present in 46.8 million people in the world, and is
characterized by the progressive decline of cognition, mainly episodic memory. AD is
multifactorial, and the accumulation of amyloid peptides (Aβ) is the main proposed
mechanism underlying neurodegeneration. Aβ are the main components of the amyloid
plaques in the brain, that are physiopathological hallmarks of the disease. Intracerebral
infusion of Aβ in rats is usually used as an animal model of DA and generates the
accumulation of these peptides in the brain together with spatial memory impairment.
However, most studies show moderate to severe deficits after chronic Aβ infusion,
without evaluation of possible subtle initial deficits. The study of the initial stages of AD
is relevant for mechanicistic and therapeutic investigations. The Barnes maze has been
used for investigating deficits in the hippocampal function in rats. The animals are
exposed to a circular apparatus with holes in its periphery. One of the holes is connected
to a safe place. In this task, rats navigate guided by distal cues to find this safe
compartment. The evaluation is conduct by parameters of general performance (latency
and distance to reach target, number of errors, among others) and by a specific analysis
of search strategies. In this way, the animal use spatial information and move directly
towards the target (direct strategy), visit sequential holes until reach the target (serial
strategy) or visit holes in a non-systematic fashion until reach the target (aleatory search).
The analysis of strategies allows the detection of alterations in the mode of solution of
the task. In the present study, we aimed to investigate initial cognitive signs of AD in
Wistar rats submitted to intracerebral infusions of Aβ, as well as the effects of a
potentially neuroprotective treatment, by the evaluation of spatial memory in the Barnes
maze. We used the alkaloid extract of Erythrina velutina (“mulungu”), which was
previously studied for anxiolytic, anti-inflammatory, antioxidant and cholinergic actions.
First, we standardized the task to our experimental conditions, and verified a possible
influence of repeated expositions to the apparatus (for future long-term protocols) or of
the implantation of the cannulas in the brain. Rats went through (or not) to implantation
of cannulas (bilaterally in the hippocampal CA1 and in the lateral ventricle) and were
exposed to 5 sequences of exposition to the Barnes maze (4 trainning sessions with 4
trials each, a 24h test and a 10-day retest sessions). Both groups showed task retrieval,
and there was a slightly improved performance in the implanted group. We concluded
that the task can be held repeatedly, and in implanted animals, without altering the
performance. In the second phase, we investigated the use of different strategies in the
Barnes maze by rats submitted to the presence of absence of distal cues. Rats were
exposed to the training phase, and in the probe session (24 h later) half the animals were
exposed to the maze in the presence of the same distal cues used in training (spatial
group), while the other rats went through the probe test without those cues (a black curtain
was placed around the maze – non-spatial group). Both groups learned the task, but the
spatial group preferred the used of direct strategies, while the non-spatial group preferred
other strategies. We concluded that the removal of distal cues does not hinder the
execution of the task, and the animals use alternative search modes under this condition.
In the third phase (two experiments) we verified the effects of the intracerebral infusion
of Aβ on the acquisition and retrieval of Barnes task. In experiment 1, rats received 15 daily i.c.v. infusions of saline or Aβ (30, 100 or 300 pmol) plus bilateral CA1 infusions
in the first day, and were exposed to 3 sequences of Barnes task (training, 24h test and
10-day retest in each sequence). Sequence I was held before surgery (all the animals
learned the task), II started at 11th infusion and III started 10 days after II. The behavior
of the Aβ-treated animals varied greatly at sequences II and III, and hence no differences
were observed. There was high mortality due to treatment. At the end of the behavioral
sessions, saline and Aβ 30pmol groups were euthanized for Aβ immunohistochemistry.
The analysis by relative optical density showed increased Aβ staining in the hippocampus
and neocortex. In experiment 2 we investigated the effects of Aβ (30 pmol) infusion on
the search strategies in the Barnes maze. Animals went through one sequence of Barnes
task (4 trainings with 2 trials each and a 3-day test, in order to increase difficulty). In the
probe test, although Aβ animals showed some retrieval, they showed preference for nonspatial
strategies, opposed to saline-treated rats. We concluded that Aβ infusion induced
subtle alterations in spatial memory, compatible with the initial stages of AD, which is
relevant for investigations of potential neuroprotective approaches. In the last stage,
animals submitted to the same infusion protocol described above were concomitantly
treated orally with 200 mg/kg of E. velutina (mulungu) extract and went through 2 Barnes
task sequences. In general, no differences were observed among the groups in acquisition
or retrieval. Thus, we concluded that the protocol used here was not able to detect a
beneficial effect of mulungu extract in the Aβ infusion AD model.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufrn.br:123456789/25471 |
| Date | 30 January 2018 |
| Creators | Macêdo, Priscila Tavares |
| Contributors | 18747270829, Sousa, Maria Bernardete Cordeiro de, 06705430478, Pereira, Rodrigo Neves Romcy, 52408493153, Barbosa, Flávio Freitas, 01202150470, Abilio, Vanessa Costhek, 25106474825, Costa, Marcos Romualdo, Silva, Regina Helena da |
| Publisher | PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS, UFRN, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFRN, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Norte, instacron:UFRN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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