Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-26T17:35:31Z No. of bitstreams: 1 KellySoaresFarias_TESE.pdf: 6619140 bytes, checksum: 0781e67a43aafb62031ffc8c16432ec1 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-27T20:19:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KellySoaresFarias_TESE.pdf: 6619140 bytes, checksum: 0781e67a43aafb62031ffc8c16432ec1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-27T20:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KellySoaresFarias_TESE.pdf: 6619140 bytes, checksum: 0781e67a43aafb62031ffc8c16432ec1 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Os astrócitos, células especializadas da glia, estão envolvidos na homeostase extracelular por tamponar íons de potássio (K+), metabolizar neurotransmissores, controlar o disparo e a sincronização neuronal e contribuir para a formação da barreira hematoencefálica. Em condições patológicas, os astrócitos podem alterar a sua morfologia (hipertrofia dos seus processos celulares) e bioquímica (aumento da expressão da proteína ácida fibrilar glial, GFAP), sendo conhecidos por astrócitos reativos (a.k.a., gliose reativa). Apesar de serem frequentemente observados em regiões cerebrais associadas à geração e propagação de crises epilépticas, a participação dos astrócitos reativos na sincronização anormal é pouco conhecida. Enquanto os astrócitos modificam o metabolismo do potássio e do glutamato, a sua reativação, por períodos prolongados, pode levar à disfunção da atividade neuronal. A epilepsia do lobo temporal (ELT), uma das formas mais comuns de epilepsia e frequentemente associada à refratariedade ao tratamento farmacológico, é caracterizada por morte neuronal em regiões temporais (esclerose do hipocampo), reorganização sináptica (brotamento aberrante de fibras musgosas) e gliose reativa. Nessa tese testamos a hipótese de que o transplante de astrócitos imaturos no hipocampo de animais cronicamente epiléticos reduzirá a atividade epileptiforme, incluindo a ocorrência de crises espontâneas eletrográficas e comportamentais. Para isso, os animais foram feitos epilépticos pela injeção sistêmica da pilocarpina (que induziu o estado epiléptico, SE) e foram transplantados unilateralmente no hilo do giro denteado (GD) com astrócitos que expressavam a proteína fluorescente verde (GFP+) 30 dias após o SE. A alocação dos animais epilépticos nos grupos controle (SE-controle) e experimental (SE-astro GD) foi feita de acordo com a severidade comportamental do SE. Atividades epileptiformes espontâneas (espículas interictais, oscilações de alta frequência e crises recorrentes) foram registradas em ambos os hipocampos (tratado e não tratado) usando eletrodos cronicamente implantados. A sobrevivência dos astrócitos foi de 1 %. Astrócitos GFP+ foram encontrados em diversas sub-regiões hipocampais por até sete meses após o transplante, sendo que algumas células migraram aproximadamente até 1500 µm no polo anteroposterior. Essas células foram localizadas principalmente no hilo, na camada granular do giro dentado e na camada molecular do hipocampo, e em alguns animais, no córtex, tálamo e fímbria. Células ou grupos de tecidos indicativos de tumor não foram identificados. A atividade epileptiforme eletrográfica foi registrada em 80% dos animais controle (SE-controle, N = 8/10), em 80% dos animais experimentais com astrócitos GFP+ localizados no córtex (SE-Astro Córtex, N = 4/5) e em 60% dos animais com astrócitos GFP+ no hipocampo (SE-Astro GD, N=2/5). A frequência de crises espontâneas foi variável entre os animais (21 vs 12 vs 1 crises espontâneas registradas nos grupos SE-control, SEAstro Córtex e SE- Astro GD, respectivamente) e não houve diferença na frequência de crises entre os grupos (crises/hora: 0,05 ± 0,01 vs 0,03 ± 0,003 vs 0,02, para SE-controle e SE-Astro Córtex e SE-Astro GD, respectivamente). O transplante dos astrócitos não alterou a duração das crises (67,5 ± 3,6 s vs 74,2 ± 3,9 s vs 65,3, para SE-controle e SE-Astro Córtex e SE-Astro GD, respectivamente). Além disso, não observamos diferenças quanto à morfologia, periodicidade ou frequência das espículas interictais do hipocampo entre os grupos experimentais e/ou entre os hemisférios tratados. Interessantemente, o transplante de astrócitos reduziu significativamente a severidade das crises comportamentais nos animais que receberam astrócitos no córtex (Escala livre: 5,0 ± 0,6 vs 4,0 ± 0,4, SE-controle e SE-Astro Córtex, respectivamente, p=0,02, teste de MannWhitney). O grupo SE-Astro GD apresentou apenas uma crise epiléptica e, portanto, não candidato a estatística. Nossos resultados enfatizam o uso da terapia celular para o tratamento das epilepsias e reforçam a importância do sítio do transplante para a redução da atividade epileptiforme. / Astrocytes are specialized glial cells involved in the extracellular homeostasis by buffering potassium cation (K+) concentration, metabolizing neurotransmitters, controlling neuronal firing and synchronization and contributing to the blood-brain barrier. Under pathological conditions, astrocytes may change their morphology in order to compensate abnormal function, being referred to as activated astrocytes (reactive gliosis). This phenomenon is commonly observed in brain regions associated with seizure generation and spread, although its role in abnormal synchronization is unknown. While astrocytes can enhance potassium and glutamate-related metabolism, sustained long-term reactivation can lead to neuronal dysfunction. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy and is usually associated to refractoriness. TLE is characterized by extensive cell death (hippocampal sclerosis), synaptic reorganization (mossy fiber sprouting) and reactive gliosis. Here, we hypothesize that transplantation of immature astrocytes in chronically epileptic hippocampus would reduce epileptiform activity, including the occurrence of electrographic and behavioral seizures. To test this hypothesis, animals made epileptic by the systemic injection of pilocarpine (which induced status epilepticus, SE) were unilaterally transplanted with green fluorescent protein-positive (GFP) astrocytes into the hippocampus 30 days after the SE. Group assignment (SE-Saline e SE-Astro GD) was made according to SE behavioral severity and spontaneous epileptiform activities (interictal spikes, high-frequency oscillations, seizures) were recorded in both (treated and untreated) hippocampi using chronically implanted multi-electrodes. Astrocytes had migrated approximately 1500µm injection site, and survival rate was 1%. Astrocytes were found in the host hippocampus seven months after transplantation and were mainly localized at the hilus, at the granular layer of the dentate gyrus, at molecular layer of hippocampus. Cells or tissue clusters indicative of tumor were not identified. In a second group, astrocytes were found in the cortex and constituted the SE-Astro Cortex group. No difference was found in epileptiform activity recorded between groups. Epileptiform electrographic activity was recorded in 80% of control animals (SE-Saline, N= 8/10, in 80% of SE-Astro Cortex group (SE-Astro Córtex, N=4/5) and in 60% of animals that received astrocytes into the hippocampus (SE-Astro GD, N=2/5). Spontaneous seizure occurrence was variable between animals (21 vs 12 vs 1 recorded seizures in SE-Saline and SE-Astro Cortex and SE-Astro GD groups, respectively), however, no difference was observed in seizure frequency between groups (seizures/hour: 0.05±0.01 vs 0.03±0.003 vs 0.02, SE-Saline, SE-Astro Cortex and SE-Astro GD, respectively). Astrocytes grafting did not change seizure duration (67.5 ± 3.6 s vs 74.2 ± 3.9 s vs 65.3 s for SE-Saline, SE-Astro Cortex and SE-Astro GD groups, respectively). Also, we did not observe any difference in the morphology, periodicity or frequency of hippocampal interictal spikes between experimental groups and/or treated hemisphere. Additionally, however, the animals of SE-Astro Cortex group showed reduced behavioral seizure severity (scores: 5 ± 0.1 vs 4 ± 0.4; for SE-Saline and SE-Astro Cortex, respectively; p =0.02, Mann-Whitney test). SE-Astro GD group animals showed only one spontaneous seizure, and therefore not a candidate for statistics. Even thought the small sample size, our results present the cell therapy relevance for the treatment of epilepsies and reinforce importance of transplantation site for epileptiform activity reduction.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-06-15T21:33:24Z No. of bitstreams: 1 PriscilaTavaresMacedo_TESE.pdf: 4733124 bytes, checksum: a3932b7f344673deeaced636669ed868 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-06-19T22:34:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PriscilaTavaresMacedo_TESE.pdf: 4733124 bytes, checksum: a3932b7f344673deeaced636669ed868 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-19T22:34:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PriscilaTavaresMacedo_TESE.pdf: 4733124 bytes, checksum: a3932b7f344673deeaced636669ed868 (MD5) Previous issue date: 2018-01-30 / A doença de Alzheimer (DA) afeta cerca de 46,8 milhões de pessoas no mundo, e é caracterizada pelo declínio progressivo da função cognitiva, em especial da memória episódica. É multifatorial, e o acúmulo de peptídeos β-amiloides (Aβ) é considerado o principal mecanismo da neurodegeneração subjacente à doença. Os Aβ são os principais componentes das placas amilóides, um dos marcos fisiopatológicos no encéfalo dos pacientes. A infusão intracerebral de Aβ em ratos é um modelo animal de DA muito utilizado, produzindo seu acúmulo em regiões cerebrais afetadas, como o hipocampo e o neocórtex e, produzindo déficits cognitivos compatíveis com os sintomas, como déficits na memória espacial. Porém, a maioria dos estudos evidencia déficits equivalentes aos estágios moderado e avançado da DA após a infusão prolongada de Aβ, sem avaliar déficits sutis de estágios iniciais. Isso seria relevante para compreensão dos mecanismos fisiopatológicos e para o teste de possíveis tratamentos neuroprotetores. Uma tarefa utilizada para avaliar déficits relacionados à disfunção hipocampal em ratos é o labirinto de Barnes. Os animais são expostos a uma plataforma circular, com buracos ao redor, sendo apenas um deles conectado a um esconderijo. Nessa tarefa, os animais guiam-se por pistas distais para encontrar o local seguro. O desempenho é avaliado por parâmetros, como latência e distância até o alvo, número de visitas a buracos errados, dentre outros, e por uma análise específica de estratégias de busca usadas para atingir o alvo. O animal pode se localizar pelas pistas distais (dispostas ao redor do labirinto), utilizando informação espacial (estratégia direta) ou outros tipos de busca, visitando de maneira aleatória ou seriada buracos do aparato (estratégias não diretas). Essa avaliação permite a detecção de alterações no modo de solução da tarefa. No presente trabalho, objetivamos investigar sinais cognitivos iniciais da DA em ratos Wistar submetidos à infusão intracerebral de Aβ, e os efeitos de um potencial tratamento neuroprotetor, por meio da avaliação da memória espacial no labirinto de Barnes. Utilizamos o extrato alcalóide de Erythrina velutina (“mulungu”), cujos componentes mostram ações ansiolíticas, antiinflamatórias, antioxidantes e pró-colinérgicas. Na 1ª etapa, padronizamos a tarefa de Barnes para as nossas condições experimentais, e verificamos se há influência da repetição de exposições ao labirinto (importante para verificação de progressão de sinais cognitivos) ou da implantação das cânulas intracerebrais no desempenho dos animais. Animais que passaram ou não pela cirurgia para implantação de cânulas (bilateralmente na sub-região hipocampal CA1 e no ventrículo lateral) passaram por 5 sequências de exposição ao labirinto de Barnes (4 treinos com 4 trials cada, um teste após 24h e um teste após 10 dias). Os resultados mostraram que houve aprendizado e evocação da tarefa. Concluímos que a tarefa pode ser realizada repetidamente, e em animais com implantes cerebrais de cânulas, sem prejuízo de desempenho. Na segunda etapa, investigamos o uso de diferentes estratégias no labirinto de Barnes na presença ou ausência de pistas distais. Ratos foram expostos aos treinos no labirinto de Barnes, e no teste (24h após) parte dos animais foi exposta ao labirinto na presença de pistas distais (condição ‘espacial’) e a outra parte passou pelo teste com uma cortina preta em volta do labirinto (condição ‘nãoespacial’). Ambos os grupos aprenderam e evocaram a tarefa, entretanto os animais expostos às pistas distais preferiram o uso de estratégia direta, enquanto o grupo nãoespacial preferiu outras estratégias. Concluímos que a retirada de pistas distais não impede que os animais encontrem o alvo, e para isso utilizam estratégias de busca alternativas ao uso de informação espacial. Na terceira etapa (2 experimentos) verificamos os efeitos da infusão intracerebral de peptídeos Aβ sobre o aprendizado e a memória no labirinto de Barnes. No experimento 1, ratos receberam 15 infusões diárias de salina ou Aβ (30, 100 ou 300 pmol) i.c.v., sendo que no 1º dia de tratamento houve infusões em CA1. Foram submetidos a 3 sequências de exposição ao Barnes (treinos, teste 24h e reteste 10 dias). A sequência I foi realizada antes da cirurgia (na qual ocorreu o aprendizado para todos os animais), a II a partir da 11ª infusão, e a III 10 dias depois. Nas sequências II e III, houve grande variação do comportamento dos animais Aβ, de modo que não foram observadas diferenças entre os grupos, além de uma alta mortalidade dos animais. Ao fim dos experimentos comportamentais, os animais foram eutanasiados e submetidos à imunohistoquímica para Aβ, cuja análise por densitometria ótica relativa mostrou aumento de sua marcação no hipocampo e neocórtex. No 2º experimento verificamos os efeitos da infusão de Aβ sobre o desempenho geral e estratégias de busca no labirinto de Barnes, com algumas alterações no protocolo de infusão e execução da tarefa. Os animais (salina ou Aβ 30 pmol) foram submetidos a uma sequência de exposição ao Barnes com 4 treinos de 2 trials cada e um teste realizado 3 dias depois, visando dificultar a tarefa. Não houve diferenças entre os grupos no aprendizado. No teste, embora os animais Aβ mostrassem alguma evocação, estes utilizaram preferencialmente estratégias aleatória e seriada, enquanto o grupo salina preferiu a estratégia direta. Concluímos que a infusão de Aβ promoveu alterações sutis na memória espacial compatíveis com a manifestação inicial da DA, indicando relevância para investigações mecanicísticas e terapêuticas em estágios precoces da doença. Na última etapa, animais submetidos ao mesmo tratamento de infusão com Aβ (30 pmol) foram tratados concomitantemente com 200 mg/kg do extrato de mulungu por via oral. Os grupos (salina, Amulungu e Amulungu) foram submetidos a 2 sequências de Barnes (a partir da 11ª infusão e dez dias depois). De forma geral, não foram observadas diferenças entre os grupos nos parâmetros referentes ao aprendizado ou à evocação da tarefa. Sendo assim, concluímos que o protocolo utilizado não foi capaz de detectar um efeito benéfico do extrato de mulungu no modelo de DA por infusão de peptídeos Aβ. / Alzheimer’s disease (AD) is present in 46.8 million people in the world, and is characterized by the progressive decline of cognition, mainly episodic memory. AD is multifactorial, and the accumulation of amyloid peptides (Aβ) is the main proposed mechanism underlying neurodegeneration. Aβ are the main components of the amyloid plaques in the brain, that are physiopathological hallmarks of the disease. Intracerebral infusion of Aβ in rats is usually used as an animal model of DA and generates the accumulation of these peptides in the brain together with spatial memory impairment. However, most studies show moderate to severe deficits after chronic Aβ infusion, without evaluation of possible subtle initial deficits. The study of the initial stages of AD is relevant for mechanicistic and therapeutic investigations. The Barnes maze has been used for investigating deficits in the hippocampal function in rats. The animals are exposed to a circular apparatus with holes in its periphery. One of the holes is connected to a safe place. In this task, rats navigate guided by distal cues to find this safe compartment. The evaluation is conduct by parameters of general performance (latency and distance to reach target, number of errors, among others) and by a specific analysis of search strategies. In this way, the animal use spatial information and move directly towards the target (direct strategy), visit sequential holes until reach the target (serial strategy) or visit holes in a non-systematic fashion until reach the target (aleatory search). The analysis of strategies allows the detection of alterations in the mode of solution of the task. In the present study, we aimed to investigate initial cognitive signs of AD in Wistar rats submitted to intracerebral infusions of Aβ, as well as the effects of a potentially neuroprotective treatment, by the evaluation of spatial memory in the Barnes maze. We used the alkaloid extract of Erythrina velutina (“mulungu”), which was previously studied for anxiolytic, anti-inflammatory, antioxidant and cholinergic actions. First, we standardized the task to our experimental conditions, and verified a possible influence of repeated expositions to the apparatus (for future long-term protocols) or of the implantation of the cannulas in the brain. Rats went through (or not) to implantation of cannulas (bilaterally in the hippocampal CA1 and in the lateral ventricle) and were exposed to 5 sequences of exposition to the Barnes maze (4 trainning sessions with 4 trials each, a 24h test and a 10-day retest sessions). Both groups showed task retrieval, and there was a slightly improved performance in the implanted group. We concluded that the task can be held repeatedly, and in implanted animals, without altering the performance. In the second phase, we investigated the use of different strategies in the Barnes maze by rats submitted to the presence of absence of distal cues. Rats were exposed to the training phase, and in the probe session (24 h later) half the animals were exposed to the maze in the presence of the same distal cues used in training (spatial group), while the other rats went through the probe test without those cues (a black curtain was placed around the maze – non-spatial group). Both groups learned the task, but the spatial group preferred the used of direct strategies, while the non-spatial group preferred other strategies. We concluded that the removal of distal cues does not hinder the execution of the task, and the animals use alternative search modes under this condition. In the third phase (two experiments) we verified the effects of the intracerebral infusion of Aβ on the acquisition and retrieval of Barnes task. In experiment 1, rats received 15 daily i.c.v. infusions of saline or Aβ (30, 100 or 300 pmol) plus bilateral CA1 infusions in the first day, and were exposed to 3 sequences of Barnes task (training, 24h test and 10-day retest in each sequence). Sequence I was held before surgery (all the animals learned the task), II started at 11th infusion and III started 10 days after II. The behavior of the Aβ-treated animals varied greatly at sequences II and III, and hence no differences were observed. There was high mortality due to treatment. At the end of the behavioral sessions, saline and Aβ 30pmol groups were euthanized for Aβ immunohistochemistry. The analysis by relative optical density showed increased Aβ staining in the hippocampus and neocortex. In experiment 2 we investigated the effects of Aβ (30 pmol) infusion on the search strategies in the Barnes maze. Animals went through one sequence of Barnes task (4 trainings with 2 trials each and a 3-day test, in order to increase difficulty). In the probe test, although Aβ animals showed some retrieval, they showed preference for nonspatial strategies, opposed to saline-treated rats. We concluded that Aβ infusion induced subtle alterations in spatial memory, compatible with the initial stages of AD, which is relevant for investigations of potential neuroprotective approaches. In the last stage, animals submitted to the same infusion protocol described above were concomitantly treated orally with 200 mg/kg of E. velutina (mulungu) extract and went through 2 Barnes task sequences. In general, no differences were observed among the groups in acquisition or retrieval. Thus, we concluded that the protocol used here was not able to detect a beneficial effect of mulungu extract in the Aβ infusion AD model.