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Previous issue date: 2014-03-25 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alkaline phosphatase function is to catalyze the hydrolysis of a phosphomonoester, and
thus has the property of removing phosphate groups 5' DNA and RNA, making it an
important tool for genetic engineering. Expression of the E. coli alkaline phosphatase
gene was obtained by cloning the gene into plasmid pBR322. Subsequently phoA
structural gene was transferred to the vector pAC92 derivative of pUC18 where its
expression was regulated partly yielding the recombinant plasmid capable of
programming in E. coli highest level of expression. But this vector has the need to
control the expression with glucose medium, otherwise the excess of the enzyme in the
periplasm causes cell death of the host. In work carried out in the Laboratory of
Technologies of DNA called a vector UFAM Pula was built from obtaining pAC92
promoter region, restored operator, cloned in a vector called pUN, this being the
modified pUC18 lacking the gene for β - galactosidase and without its promoter region /
operator of origin. This paper describes the expression of the alkaline phosphatase of E.
coli by means of the adjustable jumps expression system and purification of this
enzyme. Thus, the phoA gene was subcloned into the vector jumps successfully,
yielding the vector pUNF, which appeared stable and functional, regulated by the
induction of IPTG. The best expression of the enzyme in the system in question
occurred in the middle with a concentration of 0.05 % glucose, with 1 mM IPTG and
after 18 hours of induction. / A fosfatase alcalina tem como função catalisar a hidrólise de um fosfomonoéster, e
assim, possui a propriedade de remover grupos de fosfatos 5’ de DNA e RNA, o que
faz dela uma importante ferramenta para engenharia genética. A expressão do gene da
fosfatase alcalina de E. coli foi obtida clonando-se o gene no plasmídeo pBR322.
Posteriormente o gene estrutural phoA foi transferido para o vetor pAC92, derivado do
pUC18, onde sua expressão ficou parcialmente regulada, originando o plasmídeo
recombinante capaz de programar em E. coli maior nível de expressão. Porém este
vetor possui a necessidade do controle da expressão com glicose no meio, do
contrário, o excesso da enzima no periplasma causa a morte celular das hospedeiras.
Em trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Tecnologias de DNA da UFAM um vetor
denominado pULA foi construído a partir da obtenção da região promotora do pAC92,
com operador restaurado, clonado em um vetor denominado de pUN, este sendo o
pUC18 modificado sem o gene de β–galactosidase e sem sua região
promotora/operadora de origem. O presente trabalho descreve a expressão da
fosfatase alcalina de E. coli por meio do sistema de expressão regulável do pULA,
assim como a purificação desta enzima. Dessa forma, o gene phoA foi subclonado no
vetor pULA com sucesso, dando origem ao vetor pUNF, que se apresentou estável e
funcional, regulado pela indução do IPTG. A melhor expressão da enzima no sistema
em questão, ocorreu em meio com concentração de 0,05% de glicose, com um 1mM
de IPTG e após 18 horas de indução.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5332 |
| Date | 25 March 2014 |
| Creators | Franco, Vanessa Correa |
| Contributors | Astolfi Filho, Spartaco |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600, 500, 461231695918095045 |
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