El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar si la droga anticonvulsiva Lamotrigina (6-(2,3-diclorofenil) 1,2,4-triazina-3, 5-diamina) interacciona con el AChR. Tal objetivo se
asienta en el hecho que tanto el epifenómeno de la activación del AChR (luego de la unión con su ligando) es la permeación del Na+, al igual que el blanco farmacológico de la
Lamotrigina (LTG), explotado en terapéutica. En una primera etapa, estudiamos mediante la técnica electrofisiológica de patch-clamp si la LTG interacciona de forma directa con el AChR muscular. Elegimos este subtipo de AChR por ser el mejor caracterizado y por ser el prototipo de la familia de receptores nicotínicos. Efectivamente, al exponer las células CHO-K1/A5, que expresan AChR muscular adulto
(Roccamo et al., 1999) a la droga LTG (50-400 mM), pudimos comprobar que la LTG interacciona con los AChRs, ejerciendo un efecto bloqueador de canal abierto cuando es
co-aplicada con el agonista natural ACh (1 mM). Dicho efecto es proporcional a la concentración de LTG aplicada.
En una segunda etapa, analizamos si la LTG ejercía efectos a nivel celular, específicamente si la droga afectaba la morfología y/o la supervivencia celular. Al comparar las células CHOK1/A5 incubadas en presencia de LTG con respecto a las células control, en ausencia de la droga, comprobamos que no se afecta la morfología celular en presencia del anticonvulsivo.
Mediante la técnica de MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 difeniltetrazol, que permite estudiar cambios en la viabilidad celular, observamos que la presencia de LTG protegía a las células CHO-K1/A5 de la muerte celular frente a un estimulo nocivo, como es la ausencia de suero en los medios de cultivo. En cambio, las células parentales CHO-K1, que carecen de AChR, no se benefician de tal protección. Estos resultados sugieren que la droga LTG ejerce algún otro tipo de efecto sobre los AChRs. Un simple bloqueador de canal abierto no podría ejercer este efecto en ausencia de agonista que mediara la apertura previa del canal. En el segundo Capítulo de esta Tesis, nuevamente recurrimos a técnicas electrofisiológicas para describir que en ausencia de agonista alguno, la LTG produce la activación del canal iónico. Estos resultados se complementan con estudios farmacológicos realizados por medio de la técnica de ligazón de I125 unido a la a-bungarotoxina (a-BTX), antagonista cuasi-irreversible del AChR, y estudios adicionales de microscopía de fluorescencia y
fluorescencia en cubeta.
El Capítulo 3 de esta Tesis tuvo como objetivo la obtención de un sistema celular de mamífero que expresase en forma estable a los a7 AChRs neuronales funcionalmente
intactos en su superficie, con miras a futuros estudios farmacológicos sobre receptores del SNC. Obviamente, el requisito indispensable para tal fin es contar con expresión estable del a7 AChR. En el laboratorio se intentaron varias estrategias para intentar aumentar el nivel de expresión en membrana celular del a7 AChR (re-transfección de células en forma transiente con la subunidad a7, inducción del aumento de expresión con nicotina o con incubaciones a 25oC) (Schroeder et al., 2003) en células SHE-P1-ha7. Dichas células
expresan en forma estable al AChR neuronal a7 (Peng et al., 1999), y aunque si bien unen a-BTX, su nivel de expresión en membrana es excesivamente bajo para su detección por
técnicas de microscopía de fluorescencia o por técnicas electrofisiológicas de canal único. Es por ello que se recurrió a la tranfección de dichas células con la proteína Ric-3. Esta
proteína, descubierta inicialmente en Caenorhabditis elegans (Williams et al., 2005), es requerida para la maduración de los AChRs en células que expresan endógenamente al
AChR. Además se ha informado que la proteína Ric-3 homóloga humana aumenta la expresión de los a7 AChR en ovocitos de Xenopus laevis (Castillo et al., 2005). Efectivamente, a las 48 hs de tranfectar las células con el ADNc de la proteína Ric-3
pudimos observar por técnicas citoquímicas la expresión del a7 AChR en la superficie de las células SHE-P1-ha7. Dado el caracter transiente de dicha expresión, se obtuvo
subsecuentemente una línea celular que expresa al a7 AChR neuronal en forma permanente, obteniéndose un clon denominado SHE-P1-ha7-Ric3. Con esta nueva herramienta celular realizamos estudios farmacológicos y electrofisiológicos para caracterizarla. En el futuro se piensa estudiar posibles interacciones de LTG con el a7AChR en esta línea celular. / In this Thesis, we investigated if the anticonvulsive drug Lamotrigine (6-(2,3-dichlorophenyl) 1,2,4-triazine-3,5-diamine) interacted with the nicotinic acetylcholine receptor (AChR). Since the most common pharmacological target of Lamotrigine (LTG) is the voltage-gated Na+channel, we investigated if this drug interacted with the AChR, based on the premise that the epiphenomenon of AChR activation is the permeation of sodium ions, as is that of LTG, exploited in therapeutic intervention. We begun by studying whether exposure to LTG (1-400 mM) modified kinetic parameters of
the AChR. We chose to perform our experiments on the muscle AChR subtype because it is the best characterized prototype channel of the Ligand-gated ion channel (LGIC)
superfamily. Indeed, when CHO-K1/A5 cells heterologously expresssing adult muscle-type AChR (Roccamo et al., 1999) were exposed to LTG (50-400 mM) and studied with the
electrophysiological patch-clamp technique, we demonstrated that LTG interacted with AChRs and exerted a channel blocking effect when co-applied with ACh (1mM) in a
concentration-dependent manner. In a subsequent series of experiments, we studied whether LTG caused any effect at the cellular level, more specifically, on cell morphology and/or cell survival. LTG produced no alterations of morphological parameters with respect to cells incubated in the absence of
LTG. We subsequently resorted to the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay to assess whether LTG affected cell survival upon
submission of cells to a serum deprivation stress. CHO-K1/A5 cells were protected from cell death only after being incubated with LTG. This protection did not occur in CHO-K1 cells, devoid of AChRs. These results lead us to conclude that the anticonvulsive drug LTG displays other forms of interaction with the AChR. A simple channel blocker would not exert such an effect in the absence of a previous agonist-mediated channel opening. The second Chapter of this Thesis also employs electrophysiological techniques to describe
the direct activation of the AChR channel by LTG in the absence of an agonist. Such an effect is further supported by a combination of pharmacological radioligand binding studies
using [125I]-a-bungarotoxin (a-BTX[125I]), fluorescence spectroscopy, and fluorescence microscopy. The third Chapter of this Thesis focuses on the study of the a7 neuronal type of AChR. Our main objective was the obtention of a mammalian cell line expressing in a functional manner
a7 AChRs at the cell membrane. Several techniques were attempted in the laboratory (retranfection of the a7 subunit, incubation of the cells for 48 h in the presence of nicotine,
incubation of the cells at 25oC) in order to enhance the number of a7 AChR at the cell surface of SHE-P1-ha7 (Peng et al., 1999). Althought SHE-P1-ha7 cells express the a7
AChR in a stable manner, the level of expression is so low at the cell surface that it can not be detected by fluorescence microscopy or electrophysiological techniques at the singlechannel level. For this reason we decided to transfect the SHE-P1-ha7 cells with the Ric-3 protein.
Previous reports argued in favor of the Ric-3 protein as a necessary factor to produce levels of a7 AChR detectable at the cell surface. Ric-3 protein was first discovered in
Caenorhabditis elegans and is present in cells that endogenously express a7 AChR (Williams et al., 2005). Ric-3 has proved to increase a7 AChRs in oocytes from Xenopus
laevis (Castillo et al., 2005). As expected, 48 h after transfection with the cDNA coding for the Ric-3 protein, a7 AChR expression at the cell membrane increased. Upon selection of positive clones a cell line was obtained that expressed both a7 AChR and the Ric-3 protein in a stable manner; the new cell line was coined SHE-P1-ha7-Ric-3.
With this new cellular tool we undertook the characterization of the functional properties of a7 AChR expressed in the mammalian cell line SHE-P1-ha7-Ric3, performing
pharmacological and electrophysiological studies. In the near future we plan to study possible interactions between LTG and the neuronal a7 AChR in the SHE-P1-ha7-Ric-3 cell
line.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/2016 |
| Date | 27 March 2009 |
| Creators | Vallés, Ana Sofía |
| Contributors | Barrantes, Francisco J. |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 0 |
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