La superfamilia de canales iónicos activados por ligandos (en inglés ligand gated ion channels, LGIC) incluye al receptor de acetilcolina nicotínico (AChR, neuronal y muscular), los receptores del ácido γ-amino butírico (GABAAR), el receptor de glicina (GlyR) y el subtipo 3 de los receptores de serotonina (5-HTR3). Dentro de esta superfamilia, el AChR es uno de los receptores mejor caracterizados y constituye el prototipo de los LGIC. El AChR muscular es un oligómero heteropentamérico compuesto por dos subunidades α y tres subunidades adicionales β, γ y δ, en una estequiometría α2βγδ en el AChR muscular fetal, mientras que en el adulto la subunidad γ es reemplazada por la subunidad ε. Este receptor se encuentra en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular. La unión de su agonista natural, la acetilcolina (ACh) causa la activación del AChR, provocando un cambio conformacional en la proteína, con rápida apertura del canal y la entrada de iones sodio al interior celular. Debido a que el AChR es una proteína integral de membrana plasmática, sus dominios hidrofóbicos transmembrana se hallan en contacto con los lípidos presentes en la bicapa. Estos lípidos interaccionan con diversos dominios del receptor modulando su funcionalidad. En esta Tesis estudiamos los efectos promovidos por alteraciones en los niveles de lípidos celulares tales como el colesterol, la esfingomielina o ceramidas, sobre la síntesis y el tráfico del AChR, así como también sobre su afinidad por ligandos y estabilidad en la membrana plasmática. Todos estos parámetros fueron evaluados utilizando como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular desarrollada en nuestro laboratorio que expresa en forma heteróloga estable el AChR de tipo muscular adulto (α2βδε). En primer lugar, evaluamos los efectos de la depleción metabólica crónica del colesterol por la droga Mevinolina, potente inhibidor de la enzima microsomal 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa, enzima limitante en la biosíntesis de colesterol. Se logró determinar que cuando los niveles de colesterol celular son disminuidos por acción de esta droga, el número de AChRs presentes en la membrana plasmática de células CHO-K1/A5 sufre una drástica disminución (46%), con un aumento concomitante en el número de receptores intracelulares. Dichas variaciones se produjeron por inhibición del tráfico exocítico de la proteína con la consecuente retención del AChR a nivel del TGN. De igual modo, observamos que en condiciones controles el AChR se localiza parcialmente en membranas resistentes a detergentes (DRMs o balsas lipídicas) de retículo endoplasmático y Golgi, y que la depleción del colesterol afecta esta distribución, disminuyendo la proporción de AChRs presentes en dichos dominios de membrana. En conjunto, estos resultados nos permitieron concluir que el colesterol modula el transporte de nuevos AChRs hacia la superficie celular, a través de la asociación de dichos receptores con plataformas lipídicas enriquecidas en colesterol. En segundo lugar, estudiamos los efectos ejercidos por las ceramidas, precursoras en la síntesis de esfingolípidos, sobre diferentes propiedades del AChR. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de ceramidas de corta o larga cadena, o bien se expusieron a la incubación con esfingomielinasa para evaluar los efectos promovidos por la generación de ceramidas endógenas. Se logró demostrar la efectividad de las ceramidas en modular no sólo el tráfico del AChR sino también su afinidad por ligandos. En cuanto al tráfico del receptor, se demostró que las ceramidas ejercen una modulación dual de este proceso, aumentando o disminuyendo el número de AChRs en la superficie celular, dependiendo de la concentración de lípido utilizada. Con respecto a la afinidad del AChR por el ligando αBTX, se observó un aumento de la misma cuando las células son incubadas a altas concentraciones (25 ó 37.5 μM) de ceramidas, mientras que a bajas concentraciones del lípido (5 μM) no se produjeron tales cambios. Finalmente, se determinó que la generación de ceramidas endógenas por tratamiento con esfingomielinasa también fue efectiva en promover la disminución de los niveles de AChR en la membrana celular, a través del aumento en la tasa de endocitosis del receptor. / The ligand-gated ion channel superfamily (LGIC) comprises the nicotinic acetylcholine receptor (AChR, neuronal and muscle-types), the γ-amino butyric acid receptor (GABAAR), the glycine receptor (GlyR) and the serotonin receptor subtype 3 (5-HTR3). Within this superfamily, the AChR is the best characterized and is considered as the prototype LGIC. The muscle AChR is an heteropentamer composed of two α subunits and three additional subunits (β, γ, δ) in the stoichiometry α2βγδ (in the foetal AChR) whereas in the adult receptor form the γ subunit is replaced with the ε. This receptor is present at the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction. The binding of its natural agonist, acetylcholine (ACh), leads to the activation of the AChR, causing a conformational change in the protein, with the rapid aperture of the channel and the entry of sodium ions inside the cell. On account of the fact that the AChR is an integral membrane protein, its hydrophobic transmembrane domains are in close contact with the bilayer lipids. These lipids interact with various domains of the receptor, thereby modulating its functionality. In the present Thesis we study the effects exerted either by alterations of cellular lipids such as cholesterol, sphingomyelin, or ceramides, on the synthesis and trafficking of the AChR, as well as on its affinity for ligands and stability in the plasma membrane. All these parameters were evaluated using, as experimental model, CHO-K1/A5 cells, a cell line developed in our laboratory that heterologously express the adult form of the AChR (α2βδε). Firstly, we evaluated the effects of chronic metabolic cholesterol depletion elicited by the drug Mevinolin, a potent inhibitor of the microsomal enzyme, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase, the limiting enzyme in cholesterol biosynthesis. We determined that when cellular cholesterol levels decrease, the number of AChRs present at the plasma membrane of CHO-K1/A5 cells undergo a drastic diminution (46%), with the concomitant increase in the number of intracellular receptors. These variations are due to an inhibition of the exocytic traffic of the protein with the consequent retention of the AChR at the level of the TGN. In addition, we observed that under control conditions the AChR is partially localized in detergent-resistant membranes (DRMs) obtained from the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, and that cholesterol depletion affects such distribution, decreasing the proportion of AChRs present in those membrane domains. Altogether, these results lead us to conclude that cholesterol modulates the transport of newly synthesized AChRs to the cell surface by association of these receptors with lipid platforms enriched in cholesterol. Secondly, we studied the effects exerted by ceramides, precursors in the synthesis of sphingolipids, on different properties of the AChR. To this end, the cells were either incubated with different concentrations of short-chain or long-chain ceramides or exposed to incubation with sphingomyelinase in order to evaluate the effects exerted by the generation of endogenous ceramides. We demonstrate the effectiveness of ceramide treatment in modulating not only AChR trafficking but also receptor affinity for ligands. With respect to receptor trafficking, we demonstrate that ceramides modulate this process in a dual manner, either augmenting or decreasing the number of AChRs present at the cell surface depending on the lipid concentration. In addition, we observed that the affinity of the AChR for the ligand αBTX increased when cells were incubated with high ceramide concentrations (25 or 37.5 μM). In contrast, low ceramide concentrations (5 μM) exerted no such changes. Finally, we determined that the generation of endogenous ceramides by treatment of cells with sphingomyelinase also effectively decreased AChR levels at the cell membrane by enhancing receptor endocytosis.

Las propiedades del receptor nicotínico colinérgico muscular (AChR) están reguladas por los lípidos de la membrana. Por tratarse de una proteína integral, desde su síntesis hasta su aparición en la sinapsis y posterior degradación, el AChR esta inmerso en una bicapa lipídica, cuya composición está pre-determinada y finamente controlada por la célula. Por lo tanto, el análisis funcional de la relación entre los lípidos y el AChR requiere de un sistema celular que funcione a modo de tubo de ensayo, para evitar los modelos artificiales puros con membranas reconstituídas. Con este propósito, generamos modelos celulares que expresan heteróloga y onstitutivamente el AChR y en los que se puede modificar parcial y selectivamente el contenido de ciertas especies lipídicas. En una primera etapa a través de la cotransfección del ADNc de las subunidades del AChR adulto de ratón en una línea celular con metabolismo lipídico normal, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c), establecimos el sistema de referencia. Posteriormente, generamos dos modelos experimentales con líneas celulares mutantes que eran deficientes en el metabolismo lipídico: una línea mutante de CHO-K1, denominada SPB-1deficiente en esfigomielina (SM) (Hanada et al., 1990) y otra línea derivada de CHO-K1, auxotrófica, llamada PSA-3, deficiente en fosfatidilserina (PS). Obtuvimos la estirpe SPB-1/SPH que expresa el AChR y modula, por efecto de la temperatura, la actividad de la enzima serina palmitoil transferasa (SPT), clave en la vía de síntesis de los esfingolípidos. A temperaturas de cultivo entre 33 C y 37 C la actividad de la enzima representa sólo del 4 al 8% de la actividad normal, lo cual disminuye los niveles celulares de SM y gangliósidos como el GM3 a valores menores del 1%. Con este modelo, determinamos que no existen diferencias en los parámetros electrofisiológicos y en las propiedades farmacológicas del receptor, y caracterizamos la participación activa de la SM en los mecanismos que regulan el tráfico exocítico de la proteína a la membrana plasmática. También generamos la línea clonal PSA/AChR, que expresa el AChR y no es capaz de realizar normalmente la síntesis de PS por tener alterada una de las enzimas que catalizan su síntesis. Por este motivo, requiere del agregado exógeno del fosfolípido para su normal crecimiento. Transfectadas las células y seleccionados los clones positivos, analizamos el ARN por RT-PCR para determinar la expresión de las subunidades. Con los clones elegidos realizamos ensayos de unión a [125I]α-bungarotoxina, un radioligando específico para AChR, determinándose los parámetros cinéticos y farmacológicos. Los parámetros electrofisiológicos del canal se caracterizaron por la técnica de patch-clamp y el análisis topológico de la expresión por microscopía de fluorescencia. De esta manera, en cada modelo celular caracterizamos las diferencias estructurales y topológicas del AChR causadas por las variaciones en el contenido lipídico. En el segundo capítulo de esta tesis analizamos el rol que poseen los aminoácidos que están ubicados, de cara a la membrana, en contacto directo con los lípidos. Con este propósito, modificamos la estructura primaria de la proteína por medio de mutaciones simples y dobles, en residuos cargados y muy conservados, situados en los extremos del segmento M4 a la altura de las cabezas polares de los fosfolípidos. Por co-transfección de una subunidad mutada con el resto de las subunidades en la versión salvaje, generamos cinco líneas clonales mutantes. En estos modelos se realizaron ensayos farmacológicos con [125I]-BTX, microscopía de fluorescencia y técnicas bioquímicas que nos permitieron determinar la magnitud de la expresión del receptor mutado y los cambios estructurales y funcionales que se produjeron cuando los diferentes residuos del AChR fueron mutados. / The properties of the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) are modulated by membrane lipids. As an integral protein, the AChR - from synthesis to appearance in synapses and further degradation- is immersed in a lipid bilayer. The composition of this bilayer is pre-established and finely controlled by the cell. Therefore, the functional analysis of the lipid-AChR relationship requires a cell system that behaves as test tube, to prevent pure artificial models with reconstituted membranes. For this purpose, the AChR was heterologoulsy and constitutively expressed in cell lines, where the lipid content can be partially and selectively modified. In a first stage, the reference system was established by means of transfection of adult mouse AChR subunits cDNAs into a cell line with normal lipid metabolism, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c). Then, two experimental models were generated with mutant cell lines which were defective in lipid metabolism: a CHO-K1 mutant line, called SPB-1, deficient in sphyngomyelin (SM) (Hanada et al., 1990) and another auxotrophic line derived from CHO-K1, called PSA-3 and phosphatydilserine deficient (PS). The SPB-1/SPH clone was obtained, which expresses the AChR and modulates, by effect of temperature, the activity of the serine palmitoyl transferase (SPT), which is key to the sphingolipids synthesis pathway. At culture temperatures between 33 C and 37 C, the enzyme activity represents only from 4% to 8% of normal activity, thus reducing cell levels of SM and gangliosides such as GM3 to values lower than 1%. With this model, we established that the electrophysiological parameters and the pharmacological properties of the receptor show no differences. However, we were able to characterize the active participation of SM in the mechanisms that regulate the exocytic protein traffic to the plasma membrane. In addition, a PSA/AChR clone line was generated, which expresses the AChR and is not capable to synthesize PS normally, because one of the enzymes that catalyzes this synthesis is altered. Thus, it requires exogenous PS for normal growth. Once the cells were transfected and the positive clones selected, we analyzed the RNA by RT-PCR to determine the expression of the subunits. With these clones, we performed binding studies with [125I]-bungarotoxin, an AChR specific radioligand, to determine kinetic and pharmacological parameters. The electrophysiological parameters of the channel were characterized by the patch-clamp technique and the topological analysis of the expression by fluorescence microscopy. In this way, on each cell line, we characterized the structural and topological AChR differences caused by lipid content variations. In a second stage of this Thesis, the role of the aminoacids which are located at the membrane facing extremes in direct contact with the lipids was analyzed. For this purpose, we modified the primary structure of the protein by means of simple and double mutations, in highly conserved and charged residues, located at the M4 segment extremes at the level of the phospholipid polar heads. By transfection of a mutated subunit together with the rest of the subunits in their wild-type version, we generated five mutant clone lines. These models were subjected to pharmacological tests with [125I]-BTX, fluorescence microscopy and biochemical techniques that allowed us to establish the expression amount of the mutated receptor and the structural and functional changes that took place when the different residues were mutated.

El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar si la droga anticonvulsiva Lamotrigina (6-(2,3-diclorofenil) 1,2,4-triazina-3, 5-diamina) interacciona con el AChR. Tal objetivo se asienta en el hecho que tanto el epifenómeno de la activación del AChR (luego de la unión con su ligando) es la permeación del Na+, al igual que el blanco farmacológico de la Lamotrigina (LTG), explotado en terapéutica. En una primera etapa, estudiamos mediante la técnica electrofisiológica de patch-clamp si la LTG interacciona de forma directa con el AChR muscular. Elegimos este subtipo de AChR por ser el mejor caracterizado y por ser el prototipo de la familia de receptores nicotínicos. Efectivamente, al exponer las células CHO-K1/A5, que expresan AChR muscular adulto (Roccamo et al., 1999) a la droga LTG (50-400 mM), pudimos comprobar que la LTG interacciona con los AChRs, ejerciendo un efecto bloqueador de canal abierto cuando es co-aplicada con el agonista natural ACh (1 mM). Dicho efecto es proporcional a la concentración de LTG aplicada. En una segunda etapa, analizamos si la LTG ejercía efectos a nivel celular, específicamente si la droga afectaba la morfología y/o la supervivencia celular. Al comparar las células CHOK1/A5 incubadas en presencia de LTG con respecto a las células control, en ausencia de la droga, comprobamos que no se afecta la morfología celular en presencia del anticonvulsivo. Mediante la técnica de MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 difeniltetrazol, que permite estudiar cambios en la viabilidad celular, observamos que la presencia de LTG protegía a las células CHO-K1/A5 de la muerte celular frente a un estimulo nocivo, como es la ausencia de suero en los medios de cultivo. En cambio, las células parentales CHO-K1, que carecen de AChR, no se benefician de tal protección. Estos resultados sugieren que la droga LTG ejerce algún otro tipo de efecto sobre los AChRs. Un simple bloqueador de canal abierto no podría ejercer este efecto en ausencia de agonista que mediara la apertura previa del canal. En el segundo Capítulo de esta Tesis, nuevamente recurrimos a técnicas electrofisiológicas para describir que en ausencia de agonista alguno, la LTG produce la activación del canal iónico. Estos resultados se complementan con estudios farmacológicos realizados por medio de la técnica de ligazón de I125 unido a la a-bungarotoxina (a-BTX), antagonista cuasi-irreversible del AChR, y estudios adicionales de microscopía de fluorescencia y fluorescencia en cubeta. El Capítulo 3 de esta Tesis tuvo como objetivo la obtención de un sistema celular de mamífero que expresase en forma estable a los a7 AChRs neuronales funcionalmente intactos en su superficie, con miras a futuros estudios farmacológicos sobre receptores del SNC. Obviamente, el requisito indispensable para tal fin es contar con expresión estable del a7 AChR. En el laboratorio se intentaron varias estrategias para intentar aumentar el nivel de expresión en membrana celular del a7 AChR (re-transfección de células en forma transiente con la subunidad a7, inducción del aumento de expresión con nicotina o con incubaciones a 25oC) (Schroeder et al., 2003) en células SHE-P1-ha7. Dichas células expresan en forma estable al AChR neuronal a7 (Peng et al., 1999), y aunque si bien unen a-BTX, su nivel de expresión en membrana es excesivamente bajo para su detección por técnicas de microscopía de fluorescencia o por técnicas electrofisiológicas de canal único. Es por ello que se recurrió a la tranfección de dichas células con la proteína Ric-3. Esta proteína, descubierta inicialmente en Caenorhabditis elegans (Williams et al., 2005), es requerida para la maduración de los AChRs en células que expresan endógenamente al AChR. Además se ha informado que la proteína Ric-3 homóloga humana aumenta la expresión de los a7 AChR en ovocitos de Xenopus laevis (Castillo et al., 2005). Efectivamente, a las 48 hs de tranfectar las células con el ADNc de la proteína Ric-3 pudimos observar por técnicas citoquímicas la expresión del a7 AChR en la superficie de las células SHE-P1-ha7. Dado el caracter transiente de dicha expresión, se obtuvo subsecuentemente una línea celular que expresa al a7 AChR neuronal en forma permanente, obteniéndose un clon denominado SHE-P1-ha7-Ric3. Con esta nueva herramienta celular realizamos estudios farmacológicos y electrofisiológicos para caracterizarla. En el futuro se piensa estudiar posibles interacciones de LTG con el a7AChR en esta línea celular. / In this Thesis, we investigated if the anticonvulsive drug Lamotrigine (6-(2,3-dichlorophenyl) 1,2,4-triazine-3,5-diamine) interacted with the nicotinic acetylcholine receptor (AChR). Since the most common pharmacological target of Lamotrigine (LTG) is the voltage-gated Na+channel, we investigated if this drug interacted with the AChR, based on the premise that the epiphenomenon of AChR activation is the permeation of sodium ions, as is that of LTG, exploited in therapeutic intervention. We begun by studying whether exposure to LTG (1-400 mM) modified kinetic parameters of the AChR. We chose to perform our experiments on the muscle AChR subtype because it is the best characterized prototype channel of the Ligand-gated ion channel (LGIC) superfamily. Indeed, when CHO-K1/A5 cells heterologously expresssing adult muscle-type AChR (Roccamo et al., 1999) were exposed to LTG (50-400 mM) and studied with the electrophysiological patch-clamp technique, we demonstrated that LTG interacted with AChRs and exerted a channel blocking effect when co-applied with ACh (1mM) in a concentration-dependent manner. In a subsequent series of experiments, we studied whether LTG caused any effect at the cellular level, more specifically, on cell morphology and/or cell survival. LTG produced no alterations of morphological parameters with respect to cells incubated in the absence of LTG. We subsequently resorted to the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay to assess whether LTG affected cell survival upon submission of cells to a serum deprivation stress. CHO-K1/A5 cells were protected from cell death only after being incubated with LTG. This protection did not occur in CHO-K1 cells, devoid of AChRs. These results lead us to conclude that the anticonvulsive drug LTG displays other forms of interaction with the AChR. A simple channel blocker would not exert such an effect in the absence of a previous agonist-mediated channel opening. The second Chapter of this Thesis also employs electrophysiological techniques to describe the direct activation of the AChR channel by LTG in the absence of an agonist. Such an effect is further supported by a combination of pharmacological radioligand binding studies using [125I]-a-bungarotoxin (a-BTX[125I]), fluorescence spectroscopy, and fluorescence microscopy. The third Chapter of this Thesis focuses on the study of the a7 neuronal type of AChR. Our main objective was the obtention of a mammalian cell line expressing in a functional manner a7 AChRs at the cell membrane. Several techniques were attempted in the laboratory (retranfection of the a7 subunit, incubation of the cells for 48 h in the presence of nicotine, incubation of the cells at 25oC) in order to enhance the number of a7 AChR at the cell surface of SHE-P1-ha7 (Peng et al., 1999). Althought SHE-P1-ha7 cells express the a7 AChR in a stable manner, the level of expression is so low at the cell surface that it can not be detected by fluorescence microscopy or electrophysiological techniques at the singlechannel level. For this reason we decided to transfect the SHE-P1-ha7 cells with the Ric-3 protein. Previous reports argued in favor of the Ric-3 protein as a necessary factor to produce levels of a7 AChR detectable at the cell surface. Ric-3 protein was first discovered in Caenorhabditis elegans and is present in cells that endogenously express a7 AChR (Williams et al., 2005). Ric-3 has proved to increase a7 AChRs in oocytes from Xenopus laevis (Castillo et al., 2005). As expected, 48 h after transfection with the cDNA coding for the Ric-3 protein, a7 AChR expression at the cell membrane increased. Upon selection of positive clones a cell line was obtained that expressed both a7 AChR and the Ric-3 protein in a stable manner; the new cell line was coined SHE-P1-ha7-Ric-3. With this new cellular tool we undertook the characterization of the functional properties of a7 AChR expressed in the mammalian cell line SHE-P1-ha7-Ric3, performing pharmacological and electrophysiological studies. In the near future we plan to study possible interactions between LTG and the neuronal a7 AChR in the SHE-P1-ha7-Ric-3 cell line.

En la presente Tesis estudiamos diferentes aspectos de la interacción entre el receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) y lípidos de la membrana, especialmente los esfingolípidos (SL) y el colesterol. En la primera sección estudiamos la participación de los SL sobre el tráfico hacia la membrana plasmática del AChR en un sistema de células no polarizadas de mamífero (células CHO-K1/A5). Demostramos que la inhibición de la biosíntesis de SL altera el transporte normal del AChR hacia la membrana plasmática y promueve su acumulación en el interior celular. Además, demostramos que los SL intervienen en estadios tempranos de la vía exocítica de esta proteína y que su déficit causa la retención y acumulación de receptores desensamblados en el retículo endoplasmático. Postulamos que los SLs tendrían una actividad similar a chaperonas proteicas, en calidad de chaperonas lipídicas, en el ensamblaje y tráfico del AChR. En el segundo capítulo estudiados la distribución y movilidad del AChR en la membrana plasmática de células CHO-K1/A5 y su relación con el colesterol. Determinamos que el AChR se encuentra distribuido en forma de pequeñas agrupaciones, en el orden de los 50 nm de diámetro, por lo cual denominamos a estas agrupaciones nano-agregados de AChR. La difusión del AChR en el plano de la membrana plasmática de las células CHO-K1/A5, comparable a la fracción móvil de AChRs de miotubos de rata, es dependiente del contenido de colesterol en la misma. La fracción de AChR móviles se reduce a la mitad cuando se elimina el colesterol de la membrana. Tanto interacciones directas del AChR con el colesterol, así como interacciones con el esqueleto cortinal de actina, participan en estos fenómenos. Los hallazgos presentados en esta Tesis contribuyen al conocimiento general de la modulación que ejercen los lípidos de las membranas biológicas sobre la biología celular del AChR. / In the present Thesis different aspects of the nicotinic acetylcholine receptor (AChR) and membrane lipids interactions were studied, especially sphingolipids (SL) and cholesterol. In the first section, the participation of SL on AChR trafficking to plasma membrane in a non-polarized mammalian cell system (CHO-K1/A5 cells) was analyzed. We demonstrate that the inhibition of SL biosynthesis impairs the normal transport of AChR to the plasma membrane and promotes its accumulation inside the cell. We further show that SLs intervene at an early stage of the exocytic pathway and that their depletion provokes the retention and accumulation of unassembled receptor in the endoplasmic reticulum. On the basis of these results we hypothesize that SLs display a chaperone-like activity, as lipid chaperones, in the assembly and trafficking of AChRs. In the second chapter, we studied the distribution and mobility of plasma membrane AChR in CHO-K1/A5 cells, and its relationship with cholesterol. We observed that the AChR is distributed in the form of small aggregates, having a diameter of 50 nm, whereby this clusters were called nano-aggregates of AChR. The diffusion of AChR in the plasma membrane plane of CHO-K1/A5 cells, comparable to AChR mobile fraction from rat myotubes, is dependent on cholesterol levels. The AChR mobile fraction was reduced to 50% when cholesterol was depleted from the plasma membrane. Direct interactions between AChR and cholesterol, as well interactions with the cortical actin skeleton, are involved in these phenomena. The results presented in this work contribute to general knowledge of lipid modulation on AChR cellular biology.

En esta Tesis doctoral se profundizó en el estudio de la interacción lípidoreceptor de acetilcolina nicotínico (AChR) en dos aspectos: por un lado, el mecanismo de inhibición de ácidos grasos libres (AGLs), antagonistas no competitivos del AChR, y por el otro, la ubicación del AChR en dominios líquidoordenados (Lo) condicionada por dos características particulares de la membrana. Con la finalidad de dilucidar el mecanismo de antagonismo de los AGLs sobre el AChR, se utilizaron AGLs con un doble enlace único en diferentes posiciones de una cadena acílica de 18 átomos de carbono. Estudios funcionales realizados con la técnica de patch-clamp han mostrado que solo el cis-6-18:1 y el cis-9-18:1 reducen la duración del estado de canal abierto del receptor, sugiriendo, por lo tanto, un mecanismo de bloqueo alostérico del canal. Mediante espectroscopía de fluorescencia se comprobó que todos los AGLs se ubican en la interfase lípido-AChR, quedando el cis-6-18:1 restringido a los sitios denominados sitios anulares, mientras que el resto de los AGLs ocupa también sitios no-anulares. Por otro lado, estudios de polarización de fluorescencia mostraron que el AGLs cis-9-18:1 es el que ocasiona el mayor desorden en la membrana. Se comprobó i) que todos los cis-AGLs generan cambios conformacionales del AChR a nivel transmembrana, ii) que los cis-9-18:1, cis-11- 18:1 y cis-13-18:1 perturban al AChR en su estado de reposo e iii) que los cis-6-18:1 y cis-9-18:1 son los que causan una mayor perturbación del estado desensibilizado. De esta manera, la posición e isomería del ángulo de torsión de los AGLs insaturados serían un factor clave en el bloqueo del AChR, sugiriendo entonces que los AGLs con un único doble enlace y ubicados superficialmente en la membrana inhiben en forma directa la función del AChR, posiblemente al perturbar una secuencia aminoacídica transmembrana involucrada en los cambios alostéricos necesarios para la apertura del canal iónico. Se postula que en la membrana plasmática el AChR se encuentra en dominios lipídicos denominados “balsas” (“rafts”). Sin embargo, el AChR no muestra preferencia por dominios Lo en sistemas modelo compuestos por esfingomielina (SM), colesterol (Col) y POPC (1:1:1), pero sí lo hace un segmento transmembrana (γM4) que exhibe mayor contacto con los lípidos. Es decir, su distribución no dependería exclusivamente de sus propiedades intrínsecas sino también de señales extrínsecas a la proteína. En este trabajo de Tesis se estudió la posible partición diferencial del AChR en los dominios Lo en dos sistemas modelo diferentes en función de: a) la presencia de diferentes especies puras de SM en la membrana, y b) la existencia de asimetría transbicapa en el sistema modelo, mediante el agregado de SM de cerebro (bSM) en la hemicapa externa. Tanto la existencia de asimetría como la presencia de 16:0-SM o 18:0-SM, en comparación con las bSM y 24:1-SM, producen una partición preferencial del AChR en los dominios Lo. De este modo, la localización del AChR en estos dominios depende no solo de sus propiedades sino también de las características propias de la membrana en la que se encuentra. Entender la interacción lípido-AChR es de gran importancia para determinar tratamientos que puedan mejorar o inhibir la función del AChR y tratar enfermedades que lo involucren. / In this Ph. D. thesis the understanding of the lipid-niconitic acetylcholine receptor (AChR) interaction was furthered in two aspects, namely the inhibition mechanism of free fatty acids (FFA), non-competitive AChR antagonists, and AChR location in liquid-ordered (Lo) domains conditioned by two membrane characteristics. To elucidate FFA’s antagonism mechanism, FFA with only one double bond in different positions of an 18-carbon acyl chain were tested on AChR. Patch-clamp functional studies showed that only cis-6-18:1 and cis-9-18:1 reduce the duration of the AChR open state, thus suggesting an allosteric blocking mechanism. Fluorescence spectroscopy measurements demonstrated that all FFA locate in the AChR-lipid interfase, with cis-6-18:1 restricted to anular sites, while the rest of the FFA tested also ocupy non-anular sites. Fluorescence polarization studies showed that cis-9-18:1 causes the highest membrane disorder of all FFA tested. It was determined that i) all cis-FFA generate AChR conformational changes at a transmembrane level, ii) only cis-9-18:1, cis-11-18:1 and cis-13-18:1 disturb AChR resting state and iii) cis-6-18:1 and cis-9-18:1 are the ones that cause the highest disturbance of the desensitized state. Thus, the position and isomerism of the torsion angle of unsaturated FFAs are probably a key factor in terms of AChR blockage, possibly by perturbing a transmembrane aminoacidic sequence involved in the allosteric changes necessary for ion channel gating. In the plasma membrane, AChR is postulated to be located in lipid domains known as rafts. However, AChR shows no preference for Lo domains in model systems – composed of sphingomyelin (SM), cholesterol (Chol) and POPC (1:1:1) –, but a transmembrane segment (γM4) that in closest contact with lipids does have preference for them. This means that AChR distribution seems not to exclusively depend on its intrinsic properties but on signals external to the protein. In this Ph. D. thesis a posible differential AChR partitioning in Lo domains was studied in two model systems as a function of a) the presence of different pure SM species in the membrane and b) the existence of transbilayer asymmetry in the model system, by the addition of brain SM (bSM) in the external hemilayer. Both asymmetry and the presence of either 16:0-SM or 18:0-SM, in comparison with bSM or 24:1-SM, lead to an AChR preferential partitioning in Lo domains. AChR location in these domains depends not only on its properties but also on the characteristics of the membrane in which the ion channel is immersed. Understanding lipid-AChR interaction is of great importance to determine treatments that can either improve or inhibit AChR function and, this, in turn, will help determining the treatment of diseases in which AChR is involved.

La acetilcolina ejerce un rol preponderante como neuromodulador en el sistema nervioso central, principalmente a nivel de los circuitos neuronales asociados a cognición, memoria, aprendizaje, atención, recompensa y procesamiento de la información sensorial, modificando su respuesta frente a estímulos internos y externos. La señalización colinérgica ocurre tanto por mecanismos de transmisión sináptica como extrasináptica, siendo estos últimos los principales involucrados en la modulación de la excitabilidad neuronal, la liberación presináptica de neurotransmisores, la plasticidad neuronal y la activación coordinada de distintos grupos de neuronas en el encéfalo. El efecto neuromodulador de la acetilcolina depende no sólo de su sitio de liberación y de la población neuronal blanco, sino también de los receptores a través de los cuales actúa. Por lo tanto, los receptores nicotínicos ionotrópicos constituyen una pieza clave en el sistema colinérgico del encéfalo. Estos son canales iónicos pentaméricos activados por ligando que forman parte de la familia de receptores Cys-loop. Son permeables a cationes y pueden estar formados por cinco subunidades idénticas o por combinaciones de subunidades diferentes, dando lugar a receptores homoméricos o heteroméricos respectivamente. Cada subtipo de receptor nicotínico presenta una estequiometría definida, es decir, una composición y un arreglo espacial de subunidades particular, responsable de las propiedades biofísicas, farmacológicas y funcionales del canal, que se encuentran íntimamente asociadas a su rol fisiológico diferencial. Una de las subunidades de receptor nicotínico más abundantes en el sistema nervioso central es α7, tradicionalmente reconocida por su capacidad para formar receptores homoméricos de origen evolutivo más ancestral. Sin embargo, evidencias recientes demostraron que también posee la habilidad de coensamblarse con otras subunidades para generar receptores heteroméricos, tales como el novedoso subtipo α7β2. Numerosos desórdenes neurológicos, psiquiátricos, inflamatorios y neurodegenerativos se presentan acompañados de una deficiente señalización colinérgica, por lo que estos receptores nicotínicos conformados por subunidades α7 constituyen un promisorio blanco terapéutico. En el presente trabajo de tesis se descifraron las bases moleculares de la activación y modulación de los receptores nicotínicos α7 homoméricos y heteroméricos, utilizando principalmente técnicas electrofisiológicas, con el fin de comprender el impacto diferencial de ambos subtipos en la señalización colinérgica del sistema nervioso central. El capítulo I fue dividido en tres partes y se centró en el estudio de la función molecular del receptor α7 homomérico a nivel macroscópico y microscópico. Este receptor exhibe propiedades cinéticas y farmacológicas particulares que lo tornan óptimo en la mediación de procesos de transmisión extrasinápticos, incluyendo su elevada permeabilidad a los iones calcio y su capacidad para transformar respuestas ionotrópicas transitorias en eventos de señalización metabotrópica sostenidos. En la parte I se analizaron los mecanismos moleculares de activación y modulación del receptor α7 homomérico. En presencia de acetilcolina el receptor se activó y desensibilizó con una cinética rápida, evocando mayoritariamente aperturas aisladas breves. Por el contrario, la activación alostérica presentó un mecanismo molecular radicalmente diferente, con un enlentecimiento de la cinética de desensibilización, que permitió la prolongación de las aperturas individuales y su agrupación en episodios de activación sostenidos de muy larga duración. Asimismo, se evaluó la potenciación por compuestos prototipo previamente reportados como moduladores alostéricos positivos (PAMs), clasificados como tipo I o II en base a sus efectos a nivel de corrientes macroscópicas. Si bien ambos incrementaron el pico de la corriente, los PAMs tipo I produjeron mínimos o nulos cambios en la velocidad de desensibilización del receptor, mientras que los PAMs tipo II disminuyeron dicha velocidad notoriamente e incrementaron la reactivación de receptores desde el estado desensibilizado. Para descifrar el origen molecular de dichos efectos se exploró la potenciación a nivel de corrientes unitarias. Se demostró que los PAMs no afectaron la amplitud máxima del canal, incrementaron el tiempo de estado abierto e indujeron la aparición de episodios de activación sostenidos, modificando así la cinética del receptor en los dos casos. Mientras que los PAMs tipo I promovieron episodios de activación con una duración moderada denominados bursts, los PAMs tipo II generaron clusters de muy larga duración, conformados por varios bursts agrupados. La potenciación por ambos tipos de PAMs también fue diferencialmente afectada por la temperatura, siendo los PAMs tipo II los más sensibles, con una actividad potenciadora significativamente menor a temperatura fisiológica en comparación con el accionar a temperatura ambiente. Esta información resulta muy relevante dado que usualmente la caracterización de los PAMs in vitro es llevada a cabo a temperatura ambiente, pero para su potencial uso terapéutico es indispensable el conocimiento de sus efectos a temperaturas fisiológicas. Además, se comprobó que los determinantes estructurales transmembrana influyen en la potenciación por los dos tipos de PAMs, principalmente en los PAMs tipo II, mientras que los PAMs tipo I resultan menos sensibles. Sin embargo, también se identificaron algunos PAMs tipo I notablemente influenciados por los determinantes transmembrana, con un comportamiento intermedio, más semejante al de los PAMs tipo II. En conjunto, estos resultados aportan información esencial para la implementación de agonistas y PAMs de α7 como agentes terapéuticos en desórdenes donde exista una señalización colinérgica deficiente. En la parte II se reveló una conexión entre los efectos benéficos comunes ejercidos por los flavonoides y el receptor α7 homomérico en el sistema nervioso central, ya que estos compuestos naturales presentaron actividad α7-PAM. Se evaluaron prototipos de las tres principales clases de flavonoides: genisteína, quercetina y 5,7-dihidroxi-4-fenilcumarina como neoflavonoide. Se demostró que todos ellos potenciaron las corrientes macroscópicas y microscópicas evocadas por la acetilcolina y no recuperaron receptores desde el estado desensibilizado. Dicha caracterización funcional permitió clasificarlos como PAMs tipo I. Utilizando receptores α7 mutantes y quiméricos se comprobó que los flavonoides comparten determinantes estructurales de potenciación transmembrana con otros PAMs. Estos compuestos polifenólicos no sólo aumentaron la respuesta ionotrópica del receptor α7, sino también la metabotrópica. Se verificó que los mismos potenciaron la disminución de la generación de especies reactivas de oxígeno intracelulares ejercida por la activación de α7, en forma independiente de su efecto antioxidante intrínseco. Tanto es así que la actividad α7-PAM de los flavonoides se propone como un mecanismo adicional por el cual estos compuestos naturales ejercerían su acción antioxidante y su efecto neuroprotector mediado por receptor. En la parte III se sintetizó una novedosa serie de compuestos sintéticos derivados de 1,2,3-triazol 1,4-disustituidos con grupos arilo y fosfonato, que presentaron actividad α7-PAM. El compuesto de mayor eficacia fue el derivado funcionalizado con el grupo fosfonato de metilo, el cual se comportó como PAM tipo I, potenciando las corrientes macroscópicas y microscópicas evocadas por la acetilcolina de forma compatible con su clasificación. La potenciación por este compuesto fue influenciada por los determinantes estructurales transmembrana, compartidos también por los PAMs tipo II. Además, se aplicaron diversas estrategias de relación estructura-actividad para obtener derivados más eficaces, como modificaciones en la longitud de las cadenas carbonadas, variación del grupo aromático e inversión de la geometría del triazol. Esta última fue la única que permitió conservar el accionar α7-PAM del derivado con fosfonato de metilo. Por lo tanto, estos hallazgos permiten proponer a este compuesto como un novedoso farmacóforo de interés, que no sólo exhibe actividad potenciadora por sí mismo, sino que también resulta útil como plataforma para el desarrollo de nuevos agentes potencialmente terapéuticos. El capítulo II se centró en el estudio de la función molecular del receptor α7 heteromérico, particularmente del receptor α7β2, cuya presencia ha sido confirmada en cerebro anterior basal, corteza e hipocampo. Para descifrar el impacto de la incorporación de subunidades β2 en el pentámero de subunidades α7, se generaron receptores con estequiometrías definidas y controladas mediante dos estrategias: la tecnología de concatámeros y la técnica de electrical fingerprinting, que utilizan subunidades covalentemente unidas y no enlazadas respectivamente. Se determinó que las estequiometrías conteniendo una, dos y tres subunidades β2 dieron lugar a receptores α7β2 funcionales. En relación a la activación ortostérica, a medida que el número de subunidades β2 aumentó en el arreglo pentamérico, la amplitud y la conductancia unitaria permanecieron constantes, mientras que la duración de las aperturas y de los episodios de activación sostenidos se prolongaron significativamente, debido a una disminución en la velocidad de desensibilización. La activación en episodios sostenidos o bursts constituyó la marca o huella cinética distintiva del receptor heteromérico α7β2 con respecto al receptor α7 homomérico. Además, la subunidad β2 no aportó su cara complementaria al sitio ortostérico de unión, sino que la activación eficaz por acetilcolina ocurrió únicamente a través de interfaces α7/α7. En relación a los PAMs, originalmente desarrollados como selectivos para el receptor α7 homomérico, se observó que también ejercieron modulación alostérica positiva sobre el receptor α7β2 heteromérico, pero de forma diferencial. Los PAMs tipo I fueron más selectivos para el receptor homomérico, ya que su actividad potenciadora disminuyó con la presencia de subunidades β2 en el pentámero hasta ser prácticamente nula. En cambio, los PAMs tipo II no resultaron selectivos, dado que potenciaron por igual a los receptores α7 homoméricos y heteroméricos, enmascarando sus diferencias cinéticas intrínsecas. Lo mismo ocurrió con la activación alostérica por agonistas alostéricos, que además poseen la capacidad de actuar como PAMs tipo II. Por lo tanto, este estudio constituye la primera caracterización a nivel de canal único de receptores α7 heteroméricos, demostrando las posibles estequiometrías que dan origen a receptores funcionales y la huella cinética de cada uno. Estos resultados contribuyen al entendimiento del rol distintivo de este nuevo receptor y a su identificación funcional en sistemas nativos, ya que por el momento no existen ligandos selectivos. Además, dado que los PAMs de α7 también potenciaron a α7β2, se propone a la selectividad diferencial como un parámetro importante a considerar para el diseño y desarrollo de moduladores más específicos. También se generaron receptores heteroméricos α7β4 con estequiometrías definidas, para comparar el impacto diferencial de la presencia de distintas subunidades β en el arreglo pentamérico. Las estequiometrías conteniendo una y dos subunidades β4 dieron lugar a receptores α7β4 funcionales. En la activación ortostérica de los mismos por acetilcolina, se observó que a mayor número de subunidades β4 en el pentámero la amplitud de las corrientes unitarias aumenta, a diferencia de lo ocurrido con β2; mientras que las duraciones de las aperturas y de los episodios de activación se incrementan de forma similar a lo ocurrido con β2, pero más notoriamente, con una alta frecuencia. De este modo, la funcionalidad de los receptores α7β4 en el sistema de expresión heterólogo empleado, junto con otras evidencias experimentales, sustentan la potencial existencia de otros receptores α7 heteroméricos in vivo, además del subtipo α7β2 ya identificado en el sistema nervioso central.En conjunto, el presente trabajo de tesis permitió descifrar los mecanismos moleculares de activación y modulación alostérica de los receptores homoméricos α7 y heteroméricos α7β2, los cuales exhibieron propiedades y perfiles funcionales particulares. Esto sugiere que ambos subtipos de receptores α7 podrían actuar in vivo a distinta escala temporal, pero con un patrón espacial compartido en algunas áreas del sistema de neuromodulación colinérgico, ejerciendo un impacto diferencial en los circuitos neuronales asociados a cognición y memoria. La información aportada contribuye entonces no sólo a la dilucidación del rol fisiológico distintivo de los receptores α7 homoméricos y heteroméricos con sus respectivas implicancias fisiopatológicas, sino también al diseño, desarrollo y optimización de nuevos agentes terapéuticos más selectivos. / Acetylcholine plays a major role as neuromodulator in the central nervous system, mainly at the level of neural circuits associated to cognition, memory, learning, attention, reward and sensory gating, by modifying the response to internal and external inputs. Cholinergic signaling occurs by synaptic and extrasynaptic transmission, the latter being the main mechanism involved in the modulation of neuronal excitability, presynaptic neurotransmitter release, neuronal plasticity and coordinated firing of groups of neurons in the brain. The effect of acetylcholine as a neuromodulator depends not only on the site of release and the target neuron, but also on the receptors through which acetylcholine acts. In this regard, the ionotropic nicotinic receptors are a key piece in the brain cholinergic system. They are pentameric ligand-gated ion channels, members of the Cys-loop receptor family. Nicotinic receptors are permeable to cations and can be formed by five identical subunits or different subunit combinations, giving place to homomeric or heteromeric receptors, respectively. Each nicotinic receptor subtype has a defined stoichiometry, which means a particular composition and spatial arrangement of subunits, that is responsible for the biophysical, pharmacological and functional properties of the channel and it is intimately related to the differential physiological role. One of the most abundant nicotinic subunits in the central nervous system is α7, traditionally known by its ability to form homomeric receptors due to its ancestral evolutionary origin. However, recent evidence demonstrated that α7 has also the ability to co-assemble with other subunits to generate heteromeric receptors, for instance the novel α7β2 subtype. Several neurological, mental, inflammatory and neurodegenerative disorders are accompanied by a defective cholinergic signaling, therefore, α7 nicotinic receptors are promising therapeutic targets. In this thesis, by using electrophysiological techniques, we deciphered the molecular basis of the activation and modulation of α7 homomeric and heteromeric nicotinic receptors, with the final aim of elucidating the differential impact of both subtypes in the cholinergic signaling in the central nervous system. Chapter I was divided into three parts and was focused on the study of the molecular function of α7 homomeric receptor at the macroscopic and microscopic level. This receptor exhibits particular kinetic and pharmacological properties that make it ideal for mediating extrasynaptic transmission processes, including high permeability to calcium ions and the ability to transform transient ionotropic responses into sustained metabotropic signaling events. In Part I, the molecular mechanisms of activation and modulation of α7 homomeric receptor were analysed. In the presence of acetylcholine, the receptor activated and desensitized with rapid kinetics, mostly evoking brief isolated openings. On the contrary, allosteric activation showed a radically different molecular mechanism, with a slowdown in the desensitization kinetics that allows the prolongation of individual openings and their grouping into very long-lasting sustained activation episodes. We also evaluated the potentiation by prototype compounds, previously reported as positive allosteric modulators (PAMs) and classified as type I or II depending on their effect at the macroscopic current level. Although both types of PAMs increased the peak current, type I PAMs produced minimal or no changes in the receptor desensitization rate, whereas type II PAMs decreased notoriously that rate and increased reactivation of receptors from desensitized states. To decipher the molecular origin of these effects, potentiation was explored at the single-channel current level, and revealed that both type of PAMs did not affect the maximal channel amplitude, increased open-channel lifetime and induced sustained activation episodes, thus modifying receptor kinetics in both cases. While type I PAMs provoked activation episodes with moderate duration named bursts, type II PAMs generated very long duration clusters, consisting of several grouped bursts. We showed that potentiation by both types of PAMs was differentially affected by temperature, being type II PAMs more sensitive and less active at a more physiological temperature than at room temperature. This information is useful given that PAMs have been usually characterized in vitro at room temperature, but for their therapeutic use it is necessary to know their effects at more physiological temperatures. In addition, it was demonstrated that transmembrane structural determinants influence potentiation by both types of PAMs, mainly by type II PAMs, while type I PAMs are less sensitive. Nevertheless, some type I PAMs significantly influenced by transmembrane determinants were also identified, with an intermediate behaviour, more similar to that of type II PAMs. Overall, these results provide important information required for the implementation of α7 agonists and PAMs as therapeutic tools for disorders with a defective cholinergic signaling. In Part II, a link between the common beneficial effects exerted by flavonoids and α7 homomeric receptor in the central nervous system was revealed, since these natural compounds showed α7-PAM activity. We evaluated prototypes from the three main flavonoids classes: genistein, quercetin and 5,7-dihydroxy-4-phenylcoumarin as a neoflavonoid. All flavonoids enhanced macroscopic and microscopic currents elicited by acetylcholine and did not recover receptors from the desensitized state, thus allowing us to classify them as type I PAMs. By using mutant and chimeric α7 receptors, we demonstrated that flavonoids share transmembrane structural determinants with other PAMs. These polyphenolic compounds not only increased the receptor ionotropic response, but also the metabotropic one, further reducing the generation of intracellular reactive oxygen species elicited by α7 activation, independently of their direct antioxidant activity. Thus, we propose α7-PAM activity of flavonoids as an additional mechanism by which these natural compounds might exert their receptor-mediated antioxidant action and neuroprotective effect. In Part III, a novel series of synthetic compounds derived from 1,2,3-triazoles 1,4-disubstituted with aryl and phosphonate groups that exhibited α7-PAM activity was synthetized. The most effective compound was the methyl phosphonate-functionalized derivative, which behaves as type I PAM, enhancing the macroscopic and microscopic currents elicited by acetylcholine, in a manner compatible with its classification. Potentiation was influenced by transmembrane structural determinants, also shared by type II PAMs. In addition, several structure-activity relationship strategies were applied to obtain more effective derivatives, for instance modifications of the carbon chains lengths, variation of the aromatic group and inversion of the triazole geometry. The last one allowed the compound to preserve the α7-PAM activity of the methyl phosphonate derivative. Therefore, these results propose this compound not only as a novel pharmacophore with intrinsic PAM activity, but also as a scaffold for the development of new potential therapeutic agents. Chapter II was focused on the study of the molecular function of α7 heteromeric receptors, particularly α7β2 receptor, whose presence has been confirmed in basal forebrain, cortex and hippocampus. To decipher the impact of β2 subunits incorporation into the pentamer of α7 subunits, receptors with fixed and controlled stoichiometries were generated by two approaches: concatemeric technology and electrical fingerprinting technique, which use concatenated and unlinked subunits respectively. It was determined that stoichiometries containing one, two and three β2 subunits gave place to functional α7β2 receptors. Regarding orthosteric activation, as the number of β2 subunits increased in the pentameric arrangement, the amplitude and the single-channel conductance remained constant, while durations of openings and sustained activation episodes were significantly prolonged, due to a decrease in the desensitization rate. Activation in sustained episodes or bursts conforms the kinetic signature of α7β2 heteromeric receptors with respect to α7 homomeric receptor. Moreover, β2 subunit did not provide the complementary face of the orthosteric binding site, so the efficacious activation by acetylcholine occurred only through α7/α7 interfaces. Originally developed as selective for α7 homomeric receptors, we showed that PAMs also exerted positive allosteric modulation on α7β2 heteromeric receptors, but in a differential manner. On the one hand, type I PAMs were more selective for the homomeric receptor, since their potentiating activity decreased with the presence of β2 subunits in the pentamer up to be practically null. On the other hand, type II PAMs were not selective, because they enhanced equally all α7 homomeric and heteromeric receptors, masking their intrinsic kinetic differences. The same occurred with the allosteric activation by allosteric agonists, which also have the capacity to act as type II PAMs. This study constitutes the first single-channel characterization of α7 heteromeric receptors, revealing the stoichiometries that may result in functional receptors and the kinetic signature of each one. These results contribute to the understanding of the distinctive role of this novel receptor and will help to its functional identification in native systems because no selective ligands are available to date. Since α7 PAMs also potentiated α7β2 receptors, we propose the differential selectivity as an important parameter to consider for the design and development of more specific modulators. Furthermore, α7β4 heteromeric receptors with fixed stoichiometry were generated in order to compare the differential impact of distinct β subunits presence into the pentameric arrangement. Stoichiometries containing one and two β4 subunits gave place to functional α7β4 receptors. Regarding orthosteric activation by acetylcholine, it was observed that as the number of β4 subunits in the pentamer increases, the single-channel amplitude rises unlike what occurred with β2, whereas durations of openings and sustained activation episodes increase similarly to what occurred with β2 subunits, but more significantly, with a higher frequency. The functionality of α7β4 receptors in the heterologous expression system used, together with other experimental evidences, support the potential existence of other α7 heteromeric receptors in vivo, besides the α7β2 subtype already identified in central nervous system. On the whole, this thesis work allowed to decipher the molecular mechanisms of activation and allosteric modulation of α7 homomeric and α7β2 heteromeric receptors, which exhibited particular functional profiles and properties. It suggests that both α7 receptors subtypes could act in vivo at distinct temporal scale, but with a shared spatial pattern in some areas of the neuromodulation cholinergic system, exerting a differential impact at the neural circuits associated to cognition and memory. The provided information not only contributes to elucidating the physiological role of α7 homomeric and heteromeric receptors with their respective pathophysiological implications, but also to the design, development and optimization of novel more selective therapeutic agents.

El cerebro humano está formado por una compleja red de células nerviosas que utilizan diversas señales para comunicarse entre ellas. La propagación de señales tiene lugar en la sinapsis química en donde el neurotransmisor liberado por la neurona presináptica interacciona con un receptor postsináptico específico. Los canales iónicos activados por ligandos (LGIC) median respuestas rápidas en dichas sinapsis. El rol vital de los mismos es convertir una señal química en un impulso eléctrico. Para generar una respuesta adecuada los LGIC deben ser capaces de activarse en presencia del neurotransmisor y cerrarse en su ausencia. Estos receptores están involucrados en el aprendizaje, la memoria, el movimiento y en enfermedades genéticas, y son blancos de numerosos fármacos. Los receptores pentaméricos Cys-loop son LGIC que intervienen en sinapsis químicas rápidas. La duración, amplitud y frecuencia de una respuesta sináptica es gobernada por la cinética de apertura, cierre y desensibilización del canal. Los mecanismos moleculares de estos procesos no se conocen todavía. Los receptores poseen un dominio extracelular, unidor del neurotransmisor, y una región transmembranal, formadora del poro iónico. Uno de los objetivos de este trabajo de Tesis fue dilucidar el rol funcional de la interfase entre ambos dominios. Con este fin utilizamos receptores homopentaméricos con interfases con secuencias de 7 y 5-HT3A en los diferentes loops que las componen y evaluamos los tiempos de apertura y desensibilización de los receptores formados. Esta estrategia nos permitió determinar la contribución de cada loop y las consecuencias funcionales de la interacción entre ellos. Determinamos que la interacción entre los distintos loops de la interfase permite el acoplamiento de la unión del agonista con la apertura del poro iónico y gobierna la cinética de apertura y desensibilización de los receptores Cys-loop, controlando de esta manera la duración de la respuesta sináptica y el período refractario. Los nematodos parásitos tienen importancia médica y veterinaria ya que afectan la salud del hombre y del animal. Los fármacos antihelmínticos son esenciales para controlar los nematodos parásitos. Los agentes levamisol, pirantel, morantel y oxantel, ejercen su acción actuando sobre los nAChRs de los helmintos. En los últimos años se ha demostrado que la acción de estos fármacos depende del subtipo de receptor nACh. Exploramos las bases estructurales de dichas diferencias estudiando cómo estos agentes activan a los receptores nACh muscular y 7 de mamífero utilizando la técnica electrofisiológica de Patch-clamp. Encontramos que todas estas drogas son agonistas débiles del receptor nACh muscular adulto de mamífero. Por el contrario, pirantel y morantel cambian su comportamiento a agonistas completos y más potentes que la ACh en el receptor 7. Determinamos que la posición 57, localizada en el lado complementario del sitio de unión de agonistas, es responsable de la diferente activación de los receptores nACh muscular y 7 por morantel y pirantel. Esta posición no altera la activación de ACh o de los fármacos oxantel y levamisol. El conocimiento de la activación de los nAChRs por antihelmínticos contribuirá al diseño de terapias más selectivas contra los parásitos y a comprender como éstos desarrollan resistencia a estos fármacos. / The human brain is a vast and complicated network, where billions of nerve cells use signals to communicate with each other. At chemical synapses, neurotransmitters are released from the presynaptic cell. They interact with ligand-gated ion channels (LGIC) at the postsynaptic cell that convert signals from chemical to electrical in less than one millisecond. The channels close as the neurotransmitter dissociates to terminate the synaptic event. These receptors are involved in learning, memory, movement and disease processes, and are targets for clinically relevant drugs. The pentameric Cys-loop receptors are LGIC involved in fast chemical synapsis. Following the neurotransmitter release and binding to Cys-loop receptors, the post-synaptic response is governed by the kinetics of channel activation, deactivation and desensitization. The molecular mechanisms of these processes are still unknown. Cys-loop receptors have an extracellular domain, which contains the agonist binding sites, and a transmembrane domain where the ion pore is located. One of the goals of this Thesis was to determine the functional role of the interfacial region between extracellular and transmembrane domains. We generated homomeric chimeric receptors carrying sequences of 7 or 5-HT3A at the different loops of the interface and evaluated the open channel lifetime and rate of desensitization. This strategy allowed us to determine the functional contribution of each loop and the consecuences of structural mismatching among them. We concluded that the network of loops at the binding-pore interface of homomeric receptors is essential for coupling agonist binding to channel opening and also for dictating the kinetics of gating and desensitization. Thus, this region controls the duration of the refractory period and the synaptic response. Parasitic nematodes are of medical and veterinary importance, affecting human and animal health. Anthelmintic drugs are essential to control nematode parasites. These agents, such as levamisol, pyrantel, morantel and oxantel, exert their action at nAChRs in nerve and muscle of nematodes. In the last years, it has been demonstrated that the actions of these drugs depend on nAChR subtypes. To understand the structural basis of the differential activation of anthelmintics among nAChR subtypes, we studied the activation of mammalian muscle and 7 nAChRs by these agents at the single-channel and macroscopic-current levels. We showed that anthelminitic agents are low efficacious agonists of mammalian muscle AChRs. By contrast, morantel and pyrantel are high-efficacious and more potent agonists than ACh of 7 receptor. Also, we determined that position 57, located at the complementary face of the binding site, is a main determinant of the differential activation of mammalian muscle and 7 nAChRs by morantel and pyrantel. This position is not involved in ACh, oxantel or levamisol activation. These results provide new information for further progress in drug design and help to understand how parasites develop resistance to these drugs.

El sistema nervioso está formado por una compleja red de billones de neuronas que utilizan señales específicas para comunicarse entre sí. La sinapsis química es una unión funcional entre neuronas en la que el neurotransmisor liberado por una de ellas interactúa específicamente con proteínas de membrana de la otra, los receptores postsinápticos. Los receptores de la familia cys-loop, que incluye al receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR, nicotinic acetylcholine receptor), son miembros de la superfamilia de los canales pentaméricos activados por ligando (pLGICs, pentameric ligand-gated ion channels). Están formados por cinco subunidades iguales - receptores homoméricos - o diferentes - receptores heteroméricos -. Los receptores poseen un dominio extracelular, que contiene los sitios de unión al agonista localizados entre dos subunidades adyacentes; un dominio transmembrana, que forma el canal y contiene sitios alostéricos para la acción de moduladores; y un dominio intracelular, de importancia en la conductancia del canal y en su modulación intracelular. El receptor α7 es el prototipo de receptor homopentamérico de la familia de los nAChRs. Es uno de los nAChRs más abundantes en el sistema nervioso, aunque también se encuentra presente en otros tejidos. En neuronas modula la liberación de neurotransmisores e induce respuestas estimulatorias, contribuyendo a la cognición, el procesamiento de la información sensorial y la memoria. En tejidos no neuronales está involucrado en inmunidad, inflamación y neuroprotección. Debido a sus múltiples funciones, emerge actualmente como nuevo blanco terapéutico para desórdenes neurológicos e inflamatorios. En el primer capítulo de este trabajo de tesis exploramos el rol funcional de una subunidad truncada del receptor α7 específica de humanos, dupα7. Dicha subunidad, que carece de una región del dominio N-terminal extracelular que comprende parte del sitio de unión al ligando, se encuentra asociada con desórdenes neurológicos e inmunomodulación. Utilizando expresión heteróloga en células de mamífero en conjunto con microscopía de fluorescencia y registros de electrofisiología mediante la técnica de patch clamp, determinamos que: i) dupα7 no es capaz de formar homopentámeros funcionales activables por acetilcolina o por un agonista alostérico; ii) La subunidad dupα7 puede combinarse con la subunidad α7 para formar heteropentámeros de diferentes estequiometrías, con características cinéticas similares a las del receptor α7; iii) Es necesaria la presencia de al menos dos subunidades α7 ubicadas en forma consecutiva en el heteropentámero para que los receptores sean funcionales; iv) La expresión conjunta de dupα7 y α7 disminuye la disponibilidad de sitios de unión al agonista, reduciendo la sensibilidad de los receptores. En forma global, nuestros resultados muestran que la subunidad dupα7 posee un rol modulador negativo sobre la actividad del receptor α7. En el segundo capítulo, se evaluó la modulación de los péptidos β-Amiloide 1-40 y 1-42 sobre el receptor α7. Dichos péptidos poseen un rol fundamental en la enfermedad de Alzheimer, dado que su acumulación excesiva en el cerebro provoca la formación de placas seniles, a partir de las cuales se desarrolla un proceso de neurodegeneración e inflamación. Sin embargo, evidencias más recientes sugieren que son las formas oligoméricas de β-Amiloide las especies más neurotóxicas. Empleando estudios espectrofluorimétricos y la técnica de patch clamp demostramos que: i) Los oligómeros β-Amiloide provocan cambios conformacionales en el receptor α7 que pueden ser detectados por la sonda conformacional cristal violeta; ii) Los oligómeros de péptidos β-Amiloide son capaces de activar al receptor α7 en concentraciones del orden picomolar o nanomolar bajo; iii) Los oligómeros β-Amiloide reducen la potenciación de α7 por moduladores alostéricos positivos (PAMs, positive allosteric modulators) a concentraciones del orden nanomolar o micromolar bajo; iv) La reducción de la potenciación causada por los péptidos β-Amiloide no es específica del tipo de modulador alostérico positivo. Estos resultados demuestran un rol dual, dependiente de la concentración, de los oligómeros de β-Amiloide como agonistas y como moduladores negativos de α7. El efecto inhibitorio podría contribuir al deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer. Por último, en el tercer capítulo se evaluó la acción del ion Ca2+ como modulador alostérico positivo de α7. Existen reportes sobre cationes divalentes que actúan como moduladores de los pLGICs, variando su efecto según el tipo de receptor. Sobre α7, el ion Ca2+ actúa como un PAM, pero la base mecanística de esta acción no ha sido explorada. Combinando registros de corrientes macroscópicas y de canal único en las configuraciones cell-attached e inside-out de la técnica de patch clamp demostramos que: i) La presencia del ion Ca2+ extracelular potencia la respuesta macroscópica a acetilcolina y a colina dependiendo de la concentración de agonista; ii) La ausencia de Ca2+ en la solución extracelular disminuye la frecuencia de apertura del canal y aumenta levemente la corriente unitaria; iii) El mecanismo por el cual el ion Ca2+ potencia la respuesta al agonista es compatible con el aumento de la probabilidad de apertura del canal. De este modo, identificamos el mecanismo asociado a la acción moduladora de calcio sobre el receptor α7. Nuestros resultados contribuyen al entendimiento de la modulación del receptor α7 por una subunidad proteica asociada con enfermedades neurológicas, por péptidos amiloides producidos en patologías neurodegenerativas y por el catión Ca2+, todos procesos de relevancia en la señalización colinérgica en el sistema nervioso central. / The nervous system is formed by a complex net of billions of individual neurons that use specific signals to communicate with each other. The chemical synapse is a functional union between neurons in which the neurotransmitter released by one neuron interacts specifically with integral membrane proteins of the other neuron: the postsynaptic receptors. The receptors of the cys-loop family, that includes the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), are members of the superfamily of the pentameric ligand-gated ion channels family (pLGICs). They are formed by five identical - homopentameric receptors - or different subunits – heteropentameric receptors -. The receptors have an extracellular domain, which contains the agonist binding sites that are located between two adjacent subunits; a transmembrane domain that forms the channel and contains allosteric sites for the action of modulators; and an intracellular domain, important for the conductance of the channel and modulation. The α7 receptor is a homopentamer of the nAChRs family. It is one of the most abundant nAChRs in the nervous system and is also present in cells of other tissues. In neurons, it modulates the neurotransmitters release and induces stimulatory responses, thus contributing to cognition, sensory information processing and memory. In non-neuronal tissues, it is involved in immunity, inflammation and neuroprotection. Because of its multiple functions, it is emerging as a new therapeutic target for neurologic and inflammatory disorders. In the first chapter of this thesis we evaluated the functional role of a human-specific truncated subunit of the α7 receptor, dupα7. This subunit, which lacks part of the N-terminal extracellular ligand-binding domain, is associated with neurological disorders and immunomodulation. Using heterologous expression of heteropentamers in mammalian cells combined with fluorescence microscopy and patch clamp recordings, we determined that: i) dupα7 is not able to form functional receptors activated by acetylcholine or an allosteric agonist; ii) dupα7 subunits can combine with α7 subunits to form heteropentamers of different stoichiometries, with similar kinetic properties to those of α7; iii) the presence of at least two α7 subunits located consecutively in the heteropentamer forming an agonist binding site is necessary for functional heteropentamers; iv) the co-expression of dupα7 and α7 decreases the availability of agonist binding sites, reducing the sensibility of the receptors. Overall, our results show that dupα7 has a negative modulatory role on the activity of the α7 receptor. In the second chapter, we evaluated the modulation of α7 receptor by Amyloid- β 1-40 and 1-42 peptides. These peptides play a fundamental role in Alzheimers’ disease since their excessive accumulation in the brain causes the formation of senile plaques, from which a process of neurodegeneration and inflammation develops. More recent evidence suggests that the oligomeric forms of amyloid- β are the most neurotoxic species. Using spectrofluorimetric and electrophysiological studies we demonstrated that: i) The amyloid-β peptides cause conformational changes on the α7 receptor that can be sensed by the crystal violet conformational probe; ii) The oligomers of the amyloid-β peptide are capable of activating the α7 receptor at picomolar or low nanomolar concentrations; iii) The oligomers of the amyloid-β peptide reduce α7 potentiation by positive allosteric modulators (PAMs) at nanomolar or low-micromolar concentrations; iv) The reduction in the potentiation caused by the amyloid-β peptides is not specific of the PAM type. Our results demonstrate a dual role of the amyloid- β oligomers as agonists and negative modulators of α7, depending on the concentration. The inhibitory effect could contribute to the cognitive impair associated to Alzheimer’s disease. Last, in the third chapter we evaluated the action of the Ca2+ cation as a PAM of α7. Divalent cations have been reported to modulate different pLGICs, varying their effects with the receptor type. On α7, Ca2+ acts as a PAM, but the mechanistic basis of this action has not been explored yet. Combining macroscopic and single-channel current recordings in the cell-attached and inside-out patch clamp configurations, we demonstrated that: i) Extracellular Ca2+ potentiates the macroscopic responses to ACh and choline and the level of potentiation is dependent on the agonist concentration; ii) The absence of extracellular calcium diminishes the frequency of channel opening and slightly increases the unitary current; iii) The mechanism by which Ca2+ enhances the response to the agonist is compatible with an increase of the channel opening probability. Our results contribute to the understanding of the molecular actions at α7 of a truncated protein subunit associated with neurological diseases, of amyloid peptides produced in neurodegenerative pathologies and of the Ca2+ cation, which are all relevant modulatory processes of the cholinergic pathway at the central nervous system.

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Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-06-09T13:00:05Z No. of bitstreams: 1 Leandro Haruo Sawamura.pdf: 631191 bytes, checksum: 10a08f07560c2e5dae9d04f113f18ebf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-09T13:00:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leandro Haruo Sawamura.pdf: 631191 bytes, checksum: 10a08f07560c2e5dae9d04f113f18ebf (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / Vitamins belong to a group of organic nutrients. They are essential in small quantities to life performing several functions in the metabolism and as antioxidants or resistance inducers. The lack of vitamins may cause many developmental and metabolic problem, as well as the excess may also be toxic. However, the use of an appropriate dose is necessary. The limited number of studies on the topic relative to orchids justified the need for this work, which aimed to evaluate the influence of B vitamins, Thiamin (B1), Nicotinamide (B3) and Pyridoxine (B6) on the development and seedling growth of Cattleya labiata, Cattleya walkeriana and Cattleya brevicaulis during 120 days. The seeds were obtained from UNOESTE Orchid Seedbank. In the Tissue Culture Lab at UNOESTE the experiment was carried out in in vitro half strength MS medium for seedling growth; with the variations in the vitamins: 0.025; 0.05; 0.1 and 0.2 mg L-1 for Thiamine, and 0.125; 0.25; 0.5 and 1 mg L-1 for Pyridoxine and Nicotinamide. The increment in the fresh weight at each 30 days, dry weight at the end, shoot and root length and the number of shoots and roots parameters were evaluated. The assayed complex B vitamins, thiamine, nicotinamide and pyridoxine exhibited isolate effects in orchid seedling growth. It is recommended to reduce the thiamine dosage to 0.025 mg L-1, decrease the dosage of pyridoxine to 0.125 mg L-1, and do not add nicotinamide in any concentration in the medium. / As vitaminas pertencem a um grupo de nutrientes orgânicos, sendo essenciais em pequenas quantidades a qualquer ser vivo, desempenhando funções diversas no metabolismo e atuando como antioxidantes e indutores de resistência. A carência das vitaminas pode acarretar diversos problemas de desenvolvimento e metabolismo, assim como o excesso também pode ser tóxico. A limitada quantidade de estudos referentes ao assunto em relação a orquídeas justificou a necessidade deste trabalho, que teve como objetivo avaliar a influência das vitaminas do complexo B, tiamina (B1), nicotinamida (B3) e piridoxina (B6) no desenvolvimento e crescimento de plântulas de Cattleya labiata, Cattleya walkeriana e Cattleya brevicaulis durante 120 dias. As sementes foram obtidas do Banco de Sementes de Orquídeas do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da UNOESTE. Foi realizado o cultivo in vitro das espécies com meio de cultura MS à meia concentração contendo variações das seguintes vitaminas: para tiamina as concentrações foram 0,025; 0,05; 0,1 e 0,2 mg L-1, para piridoxina e nicotinamida foram utilizadas as concentrações 0,125; 0,25; 0,5 e 1 mg L-1. Foram avaliados parâmetros de crescimento por meio de massa fresca parcial, massa seca final, o comprimento de plântulas: de parte aérea e de raiz, e o número de brotos para cada uma das espécies. As vitaminas do complexo B testadas, tiamina (B1), nicotinamida (B3) e piridoxina (B6) apresentaram efeito isoladamente na cultura de plântulas de orquídeas. Recomenda-se reduzir a dosagem de tiamina para 0,025 mg L-1, diminuir a dosagem de piridoxina para 0,125 mg L-1 e não acrescentar nicotinamida em nenhuma concentração no meio.