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Con el objetivo de caracterizar bioquímicamente la actividad lipolítica de Pseudoalteromonas atlantica PAR 2, aislada de la Bahía de Paracas (Ica), se procedió a cultivar la bacteria en medio LB (Luria-Bertani) a temperatura ambiente durante 24 horas. Para determinar la actividad lipolítica de la Pseudoalteromonas atlantica PAR 2, se utilizó agar SW 5 % con tributirina 1 % y se incubó a temperatura ambiente por 48 horas; la hidrólisis del sustrato se evidenció por la formación de un halo transparente. Así también, se cuantificó la actividad lipolítica utilizando como sustratos por un lado tween 80 y por otro, aceite de oliva al 1 %; los cuales no fueron degradados; esta respuesta evidenció que la enzima en estudio es una lipasa del grupo VI o esterasa. Por ese motivo, se utilizó como sustrato -nitrofenol acetato en buffer fosfato 25 mM pH 7, el producto liberado se midió por espectrofotometría a 405 m y se obtuvo una actividad enzimática de 79,32 mol/mL y una actividad específica de 661,00 mol/mg de proteína en el extracto crudo. Pseudoalteromonas atlantica PAR 2 produce una lipasa del grupo VI o esterasa, la cual además presenta actividad óptima a 20 ºC, pH 7 y concentración salina 5 %. -- Palabras clave: Pseudoalteromonas atlantica, actividad lipolítica, esterasa, -nitrofenol acetato. / -- In order to characterize biochemically the lipolytic activity of Pseudoalteromonas atlantica PAR 2, isolated from the Bay of Paracas (Ica), it was proceeded to grow the bacteria in LB medium (Luria-Bertani) at environment temperature during 24 hours. To determine lipolytic activity of Pseudoalteromonas atlantica PAR 2, SW 5 % agar with tributyrin 1 % was incubated at environment temperature for 48 hours, where substrate hydrolysis was evidenced by the formation of a transparent halo. Additionally, lipolytic activity was quantified using as substrates Tween 80 on one side and on the other, olive oil, 1%, which were not degraded, this response revealed that the enzyme under study is a lipase or esterase group VI. For that reason, was used as substrate -nitrophenol acetate in 25 mM phosphate buffer pH 7, the released product was measured by spectrophotometry at 405 m and was obtained 79,32 mol/mL as enzymatic activity, and 661,00 mol/mg protein as specific activity in the crude extract. Pseudoalteromonas atlantica PAR 2 produces a lipase group VI or esterase, which also has optimal activity at 20 °C, pH 7 and 5% salt concentration. -- Keywords: Pseudoalteromonas atlantica, lipolytic activity, esterase, -nitrophenol acetate / Tesis

La superfamilia de canales iónicos activados por ligandos (en inglés ligand gated ion channels, LGIC) incluye al receptor de acetilcolina nicotínico (AChR, neuronal y muscular), los receptores del ácido γ-amino butírico (GABAAR), el receptor de glicina (GlyR) y el subtipo 3 de los receptores de serotonina (5-HTR3). Dentro de esta superfamilia, el AChR es uno de los receptores mejor caracterizados y constituye el prototipo de los LGIC. El AChR muscular es un oligómero heteropentamérico compuesto por dos subunidades α y tres subunidades adicionales β, γ y δ, en una estequiometría α2βγδ en el AChR muscular fetal, mientras que en el adulto la subunidad γ es reemplazada por la subunidad ε. Este receptor se encuentra en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular. La unión de su agonista natural, la acetilcolina (ACh) causa la activación del AChR, provocando un cambio conformacional en la proteína, con rápida apertura del canal y la entrada de iones sodio al interior celular. Debido a que el AChR es una proteína integral de membrana plasmática, sus dominios hidrofóbicos transmembrana se hallan en contacto con los lípidos presentes en la bicapa. Estos lípidos interaccionan con diversos dominios del receptor modulando su funcionalidad. En esta Tesis estudiamos los efectos promovidos por alteraciones en los niveles de lípidos celulares tales como el colesterol, la esfingomielina o ceramidas, sobre la síntesis y el tráfico del AChR, así como también sobre su afinidad por ligandos y estabilidad en la membrana plasmática. Todos estos parámetros fueron evaluados utilizando como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular desarrollada en nuestro laboratorio que expresa en forma heteróloga estable el AChR de tipo muscular adulto (α2βδε). En primer lugar, evaluamos los efectos de la depleción metabólica crónica del colesterol por la droga Mevinolina, potente inhibidor de la enzima microsomal 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa, enzima limitante en la biosíntesis de colesterol. Se logró determinar que cuando los niveles de colesterol celular son disminuidos por acción de esta droga, el número de AChRs presentes en la membrana plasmática de células CHO-K1/A5 sufre una drástica disminución (46%), con un aumento concomitante en el número de receptores intracelulares. Dichas variaciones se produjeron por inhibición del tráfico exocítico de la proteína con la consecuente retención del AChR a nivel del TGN. De igual modo, observamos que en condiciones controles el AChR se localiza parcialmente en membranas resistentes a detergentes (DRMs o balsas lipídicas) de retículo endoplasmático y Golgi, y que la depleción del colesterol afecta esta distribución, disminuyendo la proporción de AChRs presentes en dichos dominios de membrana. En conjunto, estos resultados nos permitieron concluir que el colesterol modula el transporte de nuevos AChRs hacia la superficie celular, a través de la asociación de dichos receptores con plataformas lipídicas enriquecidas en colesterol. En segundo lugar, estudiamos los efectos ejercidos por las ceramidas, precursoras en la síntesis de esfingolípidos, sobre diferentes propiedades del AChR. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de ceramidas de corta o larga cadena, o bien se expusieron a la incubación con esfingomielinasa para evaluar los efectos promovidos por la generación de ceramidas endógenas. Se logró demostrar la efectividad de las ceramidas en modular no sólo el tráfico del AChR sino también su afinidad por ligandos. En cuanto al tráfico del receptor, se demostró que las ceramidas ejercen una modulación dual de este proceso, aumentando o disminuyendo el número de AChRs en la superficie celular, dependiendo de la concentración de lípido utilizada. Con respecto a la afinidad del AChR por el ligando αBTX, se observó un aumento de la misma cuando las células son incubadas a altas concentraciones (25 ó 37.5 μM) de ceramidas, mientras que a bajas concentraciones del lípido (5 μM) no se produjeron tales cambios. Finalmente, se determinó que la generación de ceramidas endógenas por tratamiento con esfingomielinasa también fue efectiva en promover la disminución de los niveles de AChR en la membrana celular, a través del aumento en la tasa de endocitosis del receptor. / The ligand-gated ion channel superfamily (LGIC) comprises the nicotinic acetylcholine receptor (AChR, neuronal and muscle-types), the γ-amino butyric acid receptor (GABAAR), the glycine receptor (GlyR) and the serotonin receptor subtype 3 (5-HTR3). Within this superfamily, the AChR is the best characterized and is considered as the prototype LGIC. The muscle AChR is an heteropentamer composed of two α subunits and three additional subunits (β, γ, δ) in the stoichiometry α2βγδ (in the foetal AChR) whereas in the adult receptor form the γ subunit is replaced with the ε. This receptor is present at the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction. The binding of its natural agonist, acetylcholine (ACh), leads to the activation of the AChR, causing a conformational change in the protein, with the rapid aperture of the channel and the entry of sodium ions inside the cell. On account of the fact that the AChR is an integral membrane protein, its hydrophobic transmembrane domains are in close contact with the bilayer lipids. These lipids interact with various domains of the receptor, thereby modulating its functionality. In the present Thesis we study the effects exerted either by alterations of cellular lipids such as cholesterol, sphingomyelin, or ceramides, on the synthesis and trafficking of the AChR, as well as on its affinity for ligands and stability in the plasma membrane. All these parameters were evaluated using, as experimental model, CHO-K1/A5 cells, a cell line developed in our laboratory that heterologously express the adult form of the AChR (α2βδε). Firstly, we evaluated the effects of chronic metabolic cholesterol depletion elicited by the drug Mevinolin, a potent inhibitor of the microsomal enzyme, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase, the limiting enzyme in cholesterol biosynthesis. We determined that when cellular cholesterol levels decrease, the number of AChRs present at the plasma membrane of CHO-K1/A5 cells undergo a drastic diminution (46%), with the concomitant increase in the number of intracellular receptors. These variations are due to an inhibition of the exocytic traffic of the protein with the consequent retention of the AChR at the level of the TGN. In addition, we observed that under control conditions the AChR is partially localized in detergent-resistant membranes (DRMs) obtained from the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, and that cholesterol depletion affects such distribution, decreasing the proportion of AChRs present in those membrane domains. Altogether, these results lead us to conclude that cholesterol modulates the transport of newly synthesized AChRs to the cell surface by association of these receptors with lipid platforms enriched in cholesterol. Secondly, we studied the effects exerted by ceramides, precursors in the synthesis of sphingolipids, on different properties of the AChR. To this end, the cells were either incubated with different concentrations of short-chain or long-chain ceramides or exposed to incubation with sphingomyelinase in order to evaluate the effects exerted by the generation of endogenous ceramides. We demonstrate the effectiveness of ceramide treatment in modulating not only AChR trafficking but also receptor affinity for ligands. With respect to receptor trafficking, we demonstrate that ceramides modulate this process in a dual manner, either augmenting or decreasing the number of AChRs present at the cell surface depending on the lipid concentration. In addition, we observed that the affinity of the AChR for the ligand αBTX increased when cells were incubated with high ceramide concentrations (25 or 37.5 μM). In contrast, low ceramide concentrations (5 μM) exerted no such changes. Finally, we determined that the generation of endogenous ceramides by treatment of cells with sphingomyelinase also effectively decreased AChR levels at the cell membrane by enhancing receptor endocytosis.

Las propiedades del receptor nicotínico colinérgico muscular (AChR) están reguladas por los lípidos de la membrana. Por tratarse de una proteína integral, desde su síntesis hasta su aparición en la sinapsis y posterior degradación, el AChR esta inmerso en una bicapa lipídica, cuya composición está pre-determinada y finamente controlada por la célula. Por lo tanto, el análisis funcional de la relación entre los lípidos y el AChR requiere de un sistema celular que funcione a modo de tubo de ensayo, para evitar los modelos artificiales puros con membranas reconstituídas. Con este propósito, generamos modelos celulares que expresan heteróloga y onstitutivamente el AChR y en los que se puede modificar parcial y selectivamente el contenido de ciertas especies lipídicas. En una primera etapa a través de la cotransfección del ADNc de las subunidades del AChR adulto de ratón en una línea celular con metabolismo lipídico normal, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c), establecimos el sistema de referencia. Posteriormente, generamos dos modelos experimentales con líneas celulares mutantes que eran deficientes en el metabolismo lipídico: una línea mutante de CHO-K1, denominada SPB-1deficiente en esfigomielina (SM) (Hanada et al., 1990) y otra línea derivada de CHO-K1, auxotrófica, llamada PSA-3, deficiente en fosfatidilserina (PS). Obtuvimos la estirpe SPB-1/SPH que expresa el AChR y modula, por efecto de la temperatura, la actividad de la enzima serina palmitoil transferasa (SPT), clave en la vía de síntesis de los esfingolípidos. A temperaturas de cultivo entre 33 C y 37 C la actividad de la enzima representa sólo del 4 al 8% de la actividad normal, lo cual disminuye los niveles celulares de SM y gangliósidos como el GM3 a valores menores del 1%. Con este modelo, determinamos que no existen diferencias en los parámetros electrofisiológicos y en las propiedades farmacológicas del receptor, y caracterizamos la participación activa de la SM en los mecanismos que regulan el tráfico exocítico de la proteína a la membrana plasmática. También generamos la línea clonal PSA/AChR, que expresa el AChR y no es capaz de realizar normalmente la síntesis de PS por tener alterada una de las enzimas que catalizan su síntesis. Por este motivo, requiere del agregado exógeno del fosfolípido para su normal crecimiento. Transfectadas las células y seleccionados los clones positivos, analizamos el ARN por RT-PCR para determinar la expresión de las subunidades. Con los clones elegidos realizamos ensayos de unión a [125I]α-bungarotoxina, un radioligando específico para AChR, determinándose los parámetros cinéticos y farmacológicos. Los parámetros electrofisiológicos del canal se caracterizaron por la técnica de patch-clamp y el análisis topológico de la expresión por microscopía de fluorescencia. De esta manera, en cada modelo celular caracterizamos las diferencias estructurales y topológicas del AChR causadas por las variaciones en el contenido lipídico. En el segundo capítulo de esta tesis analizamos el rol que poseen los aminoácidos que están ubicados, de cara a la membrana, en contacto directo con los lípidos. Con este propósito, modificamos la estructura primaria de la proteína por medio de mutaciones simples y dobles, en residuos cargados y muy conservados, situados en los extremos del segmento M4 a la altura de las cabezas polares de los fosfolípidos. Por co-transfección de una subunidad mutada con el resto de las subunidades en la versión salvaje, generamos cinco líneas clonales mutantes. En estos modelos se realizaron ensayos farmacológicos con [125I]-BTX, microscopía de fluorescencia y técnicas bioquímicas que nos permitieron determinar la magnitud de la expresión del receptor mutado y los cambios estructurales y funcionales que se produjeron cuando los diferentes residuos del AChR fueron mutados. / The properties of the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) are modulated by membrane lipids. As an integral protein, the AChR - from synthesis to appearance in synapses and further degradation- is immersed in a lipid bilayer. The composition of this bilayer is pre-established and finely controlled by the cell. Therefore, the functional analysis of the lipid-AChR relationship requires a cell system that behaves as test tube, to prevent pure artificial models with reconstituted membranes. For this purpose, the AChR was heterologoulsy and constitutively expressed in cell lines, where the lipid content can be partially and selectively modified. In a first stage, the reference system was established by means of transfection of adult mouse AChR subunits cDNAs into a cell line with normal lipid metabolism, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c). Then, two experimental models were generated with mutant cell lines which were defective in lipid metabolism: a CHO-K1 mutant line, called SPB-1, deficient in sphyngomyelin (SM) (Hanada et al., 1990) and another auxotrophic line derived from CHO-K1, called PSA-3 and phosphatydilserine deficient (PS). The SPB-1/SPH clone was obtained, which expresses the AChR and modulates, by effect of temperature, the activity of the serine palmitoyl transferase (SPT), which is key to the sphingolipids synthesis pathway. At culture temperatures between 33 C and 37 C, the enzyme activity represents only from 4% to 8% of normal activity, thus reducing cell levels of SM and gangliosides such as GM3 to values lower than 1%. With this model, we established that the electrophysiological parameters and the pharmacological properties of the receptor show no differences. However, we were able to characterize the active participation of SM in the mechanisms that regulate the exocytic protein traffic to the plasma membrane. In addition, a PSA/AChR clone line was generated, which expresses the AChR and is not capable to synthesize PS normally, because one of the enzymes that catalyzes this synthesis is altered. Thus, it requires exogenous PS for normal growth. Once the cells were transfected and the positive clones selected, we analyzed the RNA by RT-PCR to determine the expression of the subunits. With these clones, we performed binding studies with [125I]-bungarotoxin, an AChR specific radioligand, to determine kinetic and pharmacological parameters. The electrophysiological parameters of the channel were characterized by the patch-clamp technique and the topological analysis of the expression by fluorescence microscopy. In this way, on each cell line, we characterized the structural and topological AChR differences caused by lipid content variations. In a second stage of this Thesis, the role of the aminoacids which are located at the membrane facing extremes in direct contact with the lipids was analyzed. For this purpose, we modified the primary structure of the protein by means of simple and double mutations, in highly conserved and charged residues, located at the M4 segment extremes at the level of the phospholipid polar heads. By transfection of a mutated subunit together with the rest of the subunits in their wild-type version, we generated five mutant clone lines. These models were subjected to pharmacological tests with [125I]-BTX, fluorescence microscopy and biochemical techniques that allowed us to establish the expression amount of the mutated receptor and the structural and functional changes that took place when the different residues were mutated.

El objetivo de esta tesis fue el de reunir información sobre la bioquímica de los lípidos con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de larga y muy larga cadena (VLCPUFA) que abundan en células del tracto reproductor masculino. Utilizando ratas adultas como modelo, se investigaron tres sistemas: el tejido testicular in vivo, influido por agentes que afectan la espermatogénesis, células germinales en dos etapas distintas de su diferenciación, aisladas a partir del epitelio seminífero, y espermatozoides maduros, aislados de la región caudal del epidídimo. La primera parte se centró en buscar evidencia que permitiera relacionar los lípidos en estudio con los tipos celulares presentes en los túbulos seminíferos, células germinales y de Sertoli. Se estudiaron los efectos in vivo de dos agentes que se sabe inducen la muerte de células germinales: la ciclofosfamida y la exposición a los rayos X. Algunos de los efectos tempranos de la muerte celular sobre los lípidos en estudio pudieron observarse luego de la administración de una dosis única de ciclofosfamida, mientras que las consecuencias a largo plazo de tal muerte pudieron verse claramente varias semanas después de la exposición del testículo a los rayos X. La pérdida de la línea germinal se correlacionó con una masiva pérdida del peso testicular (húmedo y seco), del fósforo lipídico y del colesterol libre, que tomó unas 6 semanas. Esto se debió a una conjunción de efectos sobre las células: 1) la muerte por apoptosis de células indiferenciadas, que fueron muy radiosensibles porque estaban en activa división al momento de irradiar (desapareciendo en un día o dos y contribuyendo, más tarde, a la despoblación del testículo); 2) aquéllas que no se estaban dividiendo en ese momento pero cuyo genoma fue dañado por los rayos X de forma tal que murieron más tarde (1-4 semanas); 3) aquéllas más diferenciadas que ya no se estaban dividiendo y no se afectaron (radiorresistentes), por lo que continuaron su diferenciación al ritmo normal de la espermatogénesis hasta que estuvieron listas para salir del testículo en forma de espermatozoides (6 semanas). Después de la 6 en adelante, y hasta la semana 30, las células de Sertoli eran las únicas pobladoras de los túbulos seminíferos. La pérdida selectiva y gradual de células de la línea germinal fue concomitante con la disminución del contenido de los glicerofosfolípidos (GPL) ricos en 22:5n-6, incluyendo en ello a los plasmalógenos, y de las esfingomielinas (SM) ricas en VLCPUFA. Estas últimas estuvieron constituidas por especies conteniendo VLCPUFA normales o no hidroxilados (como el 28:4n-6, 30:5n-6 y 32:5n-6) y VLCPUFA 2-hidroxilados (como el 2-OH 28:4n-6, 2-OH 30:5n-6 y 2-OH 32:5n-6). Después de la irradiación, las especies de SM (y de ceramida, Cer) que contienen VLCPUFA desaparecieron 2 semanas antes que las que tienen 2-OH VLCPUFA. En la ausencia de células germinales, los GPL testiculares tenían 20:4n-6 como su PUFA principal, y las SM contenían principalmente AG saturados como el 16:0, revelando la composición de los GPL y las SM de las células somáticas que sobrevivieron a la irradiación, incluyendo en este grupo a las células de Sertoli. A diferencia de los GPL, los triacilgliceroles (TAG) ricos en 22:5n-6 se mantuvieron prácticamente sin cambio durante las primeras 4 semanas, para caer drásticamente en el estrecho período entre las semanas 4 y 6 post-irradiación. Una tinción específica para gotas de lípidos neutros (Nile Red) en cortes de tejido, tanto en controles no irradiados como a la semana 4 (pero ya no más a partir de la semana 6) post-irradiación, mostró la presencia de microgotas lipídicas en las espermátidas tardías, así como en los cuerpos residuales (CR) que se desprenden de ellas. Esto sugirió que estas gotitas debían contener los TAG mencionados, cuya cantidad disminuyó abruptamente al diferenciarse las últimas espermátidas y abandonar el testículo en forma de espermatozoides. Esto fue confirmado más tarde cuando los CR mostraron ser particularmente ricos en este tipo de TAG. Los minoritarios triglicéridos con una unión éter (TUE), ricos en 22:5n-6 y VLCPUFA de 24-32 carbonos, se distinguieron de los TAG en que en las primeras semanas acumularon VLCPUFA y luego 22:5n-6. Eventualmente, ambos tipos de PUFA desaparecieron de los TUE testiculares. Más tarde se confirmó que estos lípidos no son componentes de las células germinales. Los ésteres de colesterol (EC) se asemejaron a los TUE en que inicialmente incrementaron sus VLCPUFA (28:5n-6, 30:5n-6) pero luego empezaron a acumular otros ácidos grasos, especialmente 22:5n-6. A la semana 6 post-irradiación los EC eran los únicos lípidos cuya cantidad había alcanzado valores varias veces mayor a la de los controles no irradiados. Dado que ya no había células germinales, era claro que esos EC se acumulaban en las células de Sertoli. A la semana 6, el Nile Red reveló la presencia de abundantes gotas lipídicas grandes en la zona adluminal de los túbulos seminíferos, sugiriendo que esas gotas eran los sitios celulares en que se acumulaban los EC. Teniendo en cuenta que las células germinales que mueren por apoptosis son fagocitadas por las células de Sertoli, éstas deben procesar los GPL ricos en 22:5n-6 y el colesterol provenientes de aquéllas, lo que sugiere que los EC se forman en ellas esterificando el colesterol libre con ácidos grasos liberados desde los GPL. En la segunda parte de esta tesis los lípidos de células germinales puras aisladas, espermatocitos en paquiteno (EP) de la meiosis y espermátidas redondas (ER), dos estadios bien definidos de la diferenciación, más una fracción conteniendo los cuerpos residuales (CR) que se desprenden de formas más maduras, elongadas, de las espermátidas, proveyeron varias respuestas y abrieron algunas nuevas preguntas sobre sus especiales lípidos. Por una parte, estos resultados confirmaron las conclusiones a que habíamos arribado por inferencia a partir de los estudios in vivo sobre la distribución celular de los varios lípidos en estudio. Por otra, proveyeron nuevos datos que pusieron en evidencia que, así como lo hacen los GPL, las Cer y las SM con VLCPUFA sufren cambios relevantes con la diferenciación de las células germinales. Los TAG fueron los únicos lípidos neutros en cantidades apreciables en ambos tipos celulares, así como en los cuerpos residuales, donde fueron especialmente abundantes, mientras que los TUE y los EC con PUFA y VLCPUFA fueron casi indetectables en cualquiera de las tres fracciones, reforzando la conclusión de que estos lípidos pertenecen a las células de Sertoli. Conforme avanzó la diferenciación de EP a ER, los GPL incluyendo a los plasmalógenos se volvieron progresivamente más pobres en 20:4n-6 y más ricos en 22:5n-6. Los dos tipos celulares estudiados, EP y ER, contuvieron SM y Cer con proporciones asombrosamente altas de VLCPUFA. Los VLCPUFA normales (no hidroxilados) predominaron ampliamente en la SM y Cer de los EP, mientras los 2-HO VLCPUFA lo hicieron en la SM y Cer de las ER. Esto evidenció que la formación de estas últimas especies moleculares es una característica estrechamente asociada a la diferenciación de las células germinales. Esta convicción se reforzó cuando los espermatozoides epididimales mostraron que sus SM y Cer contenían una proporción de 2-OH VLCPUFA aún mayor que las de las ER. Durante la progresión EP �� �� ER �� �� espermatozoides, el 28:4n-6 disminuyó menos que el 30:5n-6, mientras que por el contrario el 2-HO 30:5n-6 aumentó más que el 2-HO 28:4n-6 en ambos lípidos. La SM espermática tuvo al 28:4n-6 como principal y casi único VLCPUFA, y al al 2-OH 30:5n-6 como principal 2-OH VLCPUFA. Llamativamente, los CR casi no tenían Cer, y su SM sólo contuvo 2-HO VLCPUFA. En los espermatozoides de rata aislados de la región caudal del epidídimo se estudiaron las principales clases de los GPL (incluyendo plasmalógenos) y sus PUFA, así como la SM y Cer y sus VLCPUFA, para determinar su distribución entre la cabeza y la cola de las gametas. Más del 80% de los GPL se localizó en la gran cola, mientras que toda la SM con VLCPUFA y 2-HO VLCPUFA se concentró en la pequeña cabeza. La reacción SM �� Cer resultó ser altamente sensible y activa en los espermatozoides. Mediante el agregado de EDTA a los medios de aislamiento esta conversión fue inhibida, determinando así que es estrictamente dependiente de iones bivalentes, principalmente calcio. Cuando se incubaron los espermatozoides en un medio que por contener C2+bicarbonato y albúmina promueve la capacitación y, en parte, la reacción acrosomal, un porcentaje importante de los GPL y casi toda la SM fueron perdidas por las gametas. La SM con 28:4n-6, así como las SM con 2-OH VLCPUFA, propias de la cabeza espermática, se hidrolizaron para generar cantidades casi equivalentes de las correspondientes Cer. Un hallazgo sorprendente fue que mientras la cola del espermatozoide carecía completamente de SM con VLCPUFA (no hidroxilados o hidroxilados), era en cambio rica en Cer con 2-OH VLCPUFA (2-HO 28:4n-6, 2-OH 30:5n-6 y 2-OH 32:5n-6). Estos eran, en similares proporciones, los mismos VLCPUFA que aparecían en las abundantes Cer de las espermátidas redondas. Mientras los principales GPL (en especial los de colina) se remodelan en el espermatozoide a medida que progresa su maduración en el epidídimo, cambiando sus principales subclases y sus PUFA, tanto la SM con 2-OH VLCPUFA (destinada a la cabeza), como la Cer con 2-OH VLCPUFA (destinada a la cola espermática), se generan ambas en el testículo, acompañando al espermatozoide casi sin cambios desde sus primeros esbozos en el epitelio seminífero (espermátida redonda) hasta su madurez casi total después de su pasaje a través del epitelio epididimal. Las posibles funciones que cumplen estas inusuales Cer en la cola espermática serán el objeto de futuros estudios. / The aim of this work was to gather information on the biochemistry of lipids with long-chain and very-long-chain (VLC) polyunsaturated fatty acids (PUFA) that abound in cells of the mammalian reproductive tract. Using the adult rat as a model, three systems were investigated: the testicular tissue in vivo, as influenced by agents that affect spermatogenesis, germ cells in two separate stages of their differentiation, isolated from the seminiferous epithelium, and mature spermatozoa, isolated from the caudal region of the epididymis. The first part focused on finding evidence that would allow to relate the lipids under study with the cell types present in seminiferous tubules, germ cells and Sertoli cells. The in vivo effects were studied of two agents that are known to induce the death of germ cells: cyclophosphamide and exposure to X-rays. Some of the early effects of germ cell death on the lipids under study could be observed after the administration of a single dose of cyclophosphamide, whereas the long-term consequences of such death could be clearly seen several weeks after exposure of the testis to a single dose of X rays. The loss of the germ cell lineage correlated with a massive drop of the testicular weight (wet and dry), lipid phosphorus, and free cholesterol, taking about 6 weeks. This could be ascribed to a concurrence of effects on germ cells: 1) the death by apoptosis of undifferentiated germ cells that were highly radio-sensitive because they were actively dividing at irradiation time (disappearing in a day or two and contributing, later on, to the de-population of the testis); 2) those that were not dividing at that moment but that were genome-damaged by X rays in such way that they died later on (1-4 weeks); 3) those more differentiated cells that were no longer dividing, unaffected by X rays (radio-resistant), that continued their differentiation at the normal rhythm of spermatogenesis until they were ready to exit from the testis in the form of spermatozoa (6 weeks). After week 6 and onwards, up to week 30, only Sertoli cells populated the seminiferous tubules. The gradual and selective loss of cells of the germinal lineage was concomitant with the decrease of 22:5n-6-rich glycerophospholipids (GPL), including plasmalogens, and of VLCPUFA-rich sphingomyelins (SM). The latter were made up by species containing normal or non-hydroxylated VLCPUFA (such as 28:4n-6, 30:5n-6 and 32:5n-6) and 2-hydroxylated VLCPUFA (such as 2-OH 28:4n-6, 2-OH 30:5n-6 and 2-OH 32:5n-6). After irradiation, the species of SM (and ceramide, Cer) that contain VLCPUFA disappeared 2 weeks before those that contain 2-OH VLCPUFA. In the absence of germ cells, testicular GPL had 20:4n-6 as their main PUFA, and SM contained mainly saturated fatty acids like 16:0, revealing the composition of the GPL and SM of the somatic cells that survived irradiation, including Sertoli cells in this group. In disparity with GPL, the 22:5n-6-rich triacylglycerols (TAG) were maintained virtually unchanged during the first 4 weeks, to drop drastically in the short period going between weeks 4 and 6 post-irradiation. A specific staining to reveal neutral lipid droplets (Nile Red) in tissue sections from both non-irradiated controls and at week 4 (but no longer at week 6 and later) post-irradiation, showed the presence of micro-droplets both in late spermatids and in the residual bodies (RB) emitted from the latter. This suggested that these small droplets probably contained the 22:n-6-rich TAG whose amount fell down abruptly in the last 2 weeks when the last spermatids ended their differentiation and exited from the testis in the form of spermatozoa. This was confirmed later on when the RB showed to be particularly rich in this kind of TAG. The minor triglycerides with an ether bond (TEB), rich in 22:5n-6 and VLCPUFA with 24-32 carbons, differed from the TAG in that they initially accumulated VLCPUFA and then 22:5n-6. Eventually, both kinds of PUFA disappeared from the testicular TEB. These lipids were confirmed later on not to be components of germ cells. The cholesterol esters (CE) were similar to TEB in that they initially increased their VLCPUFA (28:5n-6, 30:5n-6) but then started to accumulate other fatty acids, especially 22:5n-6. At week 6 post-irradiation, EC were the only lipids whose amounts had reached values several fold higher than those of the non-irradiated controls. Since no germ cells remained in seminiferous tubules, it was clear that those EC accumulated in Sertoli cells. At week 6, Nile Red revealed the presence of abundant large lipid droplets in the adluminal zone of seminiferous tubules, suggesting that such droplets were the cellular sites of EC accumulation. Taking into account that the germ cells that die by apoptosis are phagocytized by Sertoli cells, the latter must process the 22:5n-6-rich GPL and (free) cholesterol coming from the former, suggesting that the EC are formed in Sertoli cells by esterifying free cholesterol and fatty acids released from GPL. In the second part of this thesis the lipids of pure isolated germ cells, pachytene spermatocytes (PS) of meiosis and round spermatids (RS), two well-defined stages of germ cell differentiation, plus a fraction containing the residual bodies (RB) that are released from more mature, elongating forms of spermatids, provided several answers and opened some new exciting questions on their special lipids. On the one hand, these results confirmed the conclusions arrived at by inference from the in vivo studies on the cell distribution of the various lipids under study. On the other, provided new data that put into evidence that, as the GPL do, the Cer and SM containing VLCPUFA undergo relevant changes related with germ cell differentiation. The TAG were the only neutral lipids in appreciable amounts in both cell types, as well as in the residual bodies, where they were especially abundant, whereas the PUFA- and VLCPUFA-rich TUE and EC were almost undetectable in any of the three fractions, reinforcing the conclusion that these lipids belong to Sertoli cells. significant amounts As differentiation from RS to RS proceeded, the GPL including plasmalogens became progressively poorer in 20:4n-6 and richer in 22:5n-6. Both germ cell types, PS and RS, contained SM and Cer wiith astonishingly high proportions of VLCPUFA. The normal (non-hydroxy) VLCPUFA predominated massively in the SM and Cer of the PS, whereas the 2-OH VLCPUFA prevailed in the RS. This evidenced that the formation of these latter species is a feature tightly linked to germ cell differentiation in the rat. This conviction was reinforced when spermatozoa from the epididymis showed that their SM and Cer contained a proportion of 2-OH VLCPUFA even higher than those of RS. During the progression PS �� �� RS �� �� spermatozoa, 28:4n-6 decreased less than did 30:5n-6, whereas, on the contrary, 2-OH 30:5n-6 increased more than did 2-OH 28:4n-6 in both lipids. Spermatozoal SM had 28:4n-6 as the main and almost only VLCPUFA, and 2-OH 30:5n-6 as the main VLCPUFA. Remarkably, the RB had virtually no Cer and their SM only contained 2-OH VLCPUFA. In rat spermatozoa isolated from the caudal region of the epididymis, the main classes of GPL (including plasmalogens) and their PUFA, as well as SM and Cer and their VLCPUFA were studied to determine their distribution between the head and the tail of the gametes. More than 80% of the GPL was localized in the large tail, whereas all of the SM with VLCPUFA and 2-OH VLCPUFA was concentrated in the small head. The SM → Cer reaction was highly sensitive and active in the spermatozoa. By means of adding EDTA to the isolation media this conversion was inhibited, thus determining that it is strictly dependent on bivalent ions, mostly calcium. When sperm were incubated in a medium that, because it contained Ca2+, bicarbonate and albumin promoted sperm capacitation, and, in part, the acrosome reaction, an important percentage of the total GPL and most of the SM were lost from the gametes. The 28:4n-6-containing SM as well as the 2-OH-VLCPUFA containing SM, typical of the sperm head, were hydrolyzed to generate almost equivalent amounts of the corresponding Cer. A surprising finding was that, whereas the tail of spermatozoa lacked SM with VLCPUFA altogether, it was instead rich in Cer with 2-OH VLCPUFA (2-HO 28:4n-6, 2-OH 30:5n-6 y 2-OH 32:5n-6). These were, in similar proportions, the same VLCPUFA that appeared in the abundant Cer of round spermatids. In contrast to the main sperm GPL (especially those of choline) that change their subclasses and their PUFA types while they mature in the epididymis, both the SM with normal and 2-hydroxy VLCPUFA (destined o the sperm head) and the Cer with 2-OH VLCPUFA (destined to the sperm tail) are generated in the testis and accompany the gamete almost without changes from their first appearance in the seminiferous epithelium (round spermatids) to their almost complete maturity after their passage through the epididymal epithelium. The possible functions these unusual Cer play in the sperm tail will be the aim of future studies.

La industria alimentaria necesita disponer de tecnologías y procesos industriales acordes a las exigencias actuales en cuanto a calidad nutricional y cuidado del medio ambiente, y a su vez que le resulten económicamente convenientes. Las grasas sólidas y semisólidas se han producido a partir de aceites vegetales desde hace décadas utilizando distintas tecnologías, siendo uno de los objetivos actuales de su producción evitar introducir o generar compuestos perjudicia-les para la salud del consumidor. La acidólisis enzimática, pro-ceso que consiste en utilizar lipasas como biocatalizadores para incorporar ácidos grasos específicos en la estructura de los triglicéridos, se vislumbra como una alternativa válida para cumplir dicho objetivo. En la presente tesis se estudia la producción de biocatalizadores sólidos y su accionar en la reacción de acidólisis entre aceite de girasol y ácidos grasos saturados libres, llevándola a cabo tanto en reactor batch como en uno de lecho empacado. En el Capítulo 1 se hace una introducción general al tema de estudio junto con la revisión bibliográfica general. Los materiales utilizados y los métodos generales de análisis empleados se describen en el Capítulo 2. Los métodos específicos se describen en el lugar donde se plantea su utilización. En el Capítulo 3 se analizan las características más relevantes para esta tesis del pre-parado comercial de lipasas de Rhizomucor miehei, así como la capacidad de las mismas para catalizar la reacción de interés en su estado libre. Los Capítulos 4 y 5 se centran en la pro-ducción de los biocatalizadores sólidos. En el Capítulo 4 se analizan los métodos de inmovilización de las lipasas por adsor-ción. En el Capítulo 5 se describe la preparación y modifica-ción de microesferas de quitosano a fin de ser empleadas como soportes, junto a la caracterización de las mismas me-diante diversas técnicas. Obtenido el biocatalizador que se consideró de mejor desempeño en la reacción de interés, en el Capítulo 6 se realizó el análisis de las condiciones de reacción propiamente dichas, seleccionando los niveles óptimos de las variables, y en el Capítulo 7 se indagó acerca del comporta-miento cinético de este sistema en reactores batch. La construcción y modos de funcionamiento del reactor de lecho empacado se describen en el Capítulo 8, donde también se desarrolla el modelado y simulación de este sistema, inclu-yendo la resistencia a la transferencia de materia. Por último, en el Capítulo 9 se presentan las conclusiones generales a las cuales se abordó con el estudio desarrollado en la presente tesis. / The food industry requires new technologies and processes in line with the current requirements in terms of nutritional quality and environmental care, being at the same time economically profitable. For decades, different technologies have been used to produce solid and semisolid fats. One of the main goals of current processes is to avoid the introduc-tion or generation of compounds which are harmful to human health. Enzymatic acidolysis, which consists in the incor-poration of specific fatty acids in the glycerol backbone of triglycerides, appears as a valid alternative to fulfill this objec-tive. In the present thesis the production of solid biocatalysts and their performance in the acidolysis reaction between sunflower oil and free saturated fatty acids, in batch and packed bed reactor configuration, is studied. In Chapter 1 a general introduction to the subject and the bibliographic revision are presented. The different materials employed, as well as the general analytical methods used throughout the development of this thesis, are described in Chapter 2. The specific methods are detailed in the corresponding sections where their applications are presented. The most relevant characteristics of commercial preparations of Rhizomucor miehei lipases, as well as their capability to act in free form on the reaction in study, are analyzed in Chapter 3. Chapters 4 and 5 are focused on the solid biocatalysts production. In Chapter 4 different lipase immobilization methods based on adsorption principle are analyzed. In Chapter 5 the prepara-tion and modification of chitosan microspheres intended to be used as supports, together with their characterization, are described. Once the most appropriate biocatalyst was ob-tained, the reaction conditions analysis, along with the selection of their optimum values, was developed in Chapter 6. In Chapter 7 the kinetic behaviour of batch reaction systems was studied. The construction and operating mode of the packed bed reactor are described in Chapter 8. In addition, the modeling and simulation of the system, including mass transfer resistance considerations, are also developed. Finally, the main conclusions that can be drawn from the studies developed in the present thesis are presented in Chapter 9.

El núcleo es una de las características distintivas que definen a las células eucariotas, permite una compartamentalización que es crítica para procesos que se desarrollan dentro del mismo, como la replicación, transcripción, splicing de pre-mRNA y ensamblado de ribosomas. Los Lípidos Neutros (LN) nucleares son fuentes alternativas de ácidos grasos (FA) y colesterol para membranas, vías de señalización y ligandos de factores de transcripción. Los objetivos de la presente tesis fueron: 1) Determinar la organización estructural y espacial de los lípidos nucleares. 2) Determinar el o los mecanismos de incorporación de los ácidos grasos (FA) exógenos en los lípidos nucleares. Como modelo experimental se trabajó con núcleos y matrices nucleares aislados de hígado de rata. La pureza de las fracciones aisladas se determinó mediante ensayos morfológicos y bioquímicos y se corroboró la alta pureza e integridad de cada fracción. Mediante análisis bioquímicos tradicionales se determinó la composición lipídica nuclear y se pudo concluir que los lípidos nucleares se ubican en dos localizaciones principales, la doble membrana nuclear compuesta de glicerofosfolípidos, esfingolípidos y colesterol; y dentro del núcleo, los lípidos endonucleares están enriquecidos en triacilglicéridos (TAG) y ésteres de colesterol (CE). En particular, los LN nucleares se organizan en la matríz nuclear como Gotas Lipídicas nucleares (nLD), que serían análogas a las gotas lípidicas citosólicas (cLD). Esta hipótesis fue corroborada al observar nLD en el interior de núcleos y matrices aislados de hígado de rata, en hepatocitos de rata y en células HepG2, mediante microscopía de campo claro y de fluorescencia en muestras tratadas con coloraciones específicas para lípidos. Las nLD se caracterizan por ser esferas, de número limitado por núcleo y estar separadas espacialmente de los dominios nucleares nucleolo, Speckles y Paraspeckles y lámina nucleas. Poseen además diámetros menores a los de las cLD. Se elaboró un protocolo para aislar nLD de los demás componentes nucleares y se corroboró la presencia de gotas de lípidos en la fracción aislada por microscopía de campo claro y electrónica con tinciones específicas. Las nLD son estructuras supramoleculares nucleares compuestas principalmente por CE, C, TAG y proteínas, con una baja proporción de lípidos polares. Las nLD constituyen un nuevo dominio nuclear donde los LN se almacenan y organizan y seguramente participan en la homeostasis lipídica nuclear. Las nLD podrían actuar como un sistema buffer endonuclear proveyendo o incorporando lípidos y proteínas involucrados en diferentes procesos. Se determinó que la membrana nuclear corresponde a una zona de fluidez mayor a la de la membrana plasmática y la matriz nuclear es más rígida, utilizando la sonda Laurdan y microscopía de 2 fotones. Para evaluar el mecanismo de incorporación FA exógenos en los lípidos nucleares se incubaron núcleos con distintos [14C]FA y se analizó la incorporación de la radiactividad en los lípidos. Los FA saturados y polinosaturados exógenos estudiados se incorporan como FA y se esterifican en los lípidos nucleares. Los FA no se esterifican directamente a los pooles lipídicos nucleares sino que primero deben ser convertidos en ésteres de CoA. Este proceso es llevado a cabo por acción de acil-CoA sintetasas. Los ácidos 16:0, 18:0, 18:1n-9, 18:2n-6 y 20:4n-6 se esterifican en los lípidos nucleares. Los FA ensayados se incorporan como FA libre tanto en núcleos, membranas nucleares aisladas, matrices nucleares como en las nLD y se esterifican en los lípidos de las mismas (LP y LN en los núcleos, matrices y nLD y LP en las membranas nucleares). Sin embargo, los FA no se esterifican en lípidos de nLD aisladas en las condiciones ensayadas, esto pude deberse a que se necesiten componentes nucleares que se pierden durante el aislamiento o que no haya remodelado de FA dentro de la gota. La L-FABP participa en la movilización y transporte de FA nucleares. Existe un transporte reverso de FA unidos a L-FABP desde los pooles lipídicos nucleares y endonucleares (matrices nucleares) hacia el citosol. La L-FABP moviliza al 20:4n-6, 18:0 y 18:1n-9 fuera del núcleo hacia otros compartimentos celulares. Estimula la movilización y redistribución de los mismos dentro del núcleo entre los diferentes pooles lipídicos. En especial, determina un incremento de 20:4n-6 esterificado en PI. El PI de la matriz nuclear forma parte del activo sistema de transducción de señales del núcleo, y la L-FABP estaría favoreciendo la adecuada composición de este fosfolípido. El 20:4n-6 movilizado por la L-FABP de los pooles endonucleares, podría ser el ligando de factores de transcripción, en particular del PPARα, dado que existe colocalización entre PPARα y L-FABP. / Los resultados obtenidos de esta tesis fueron premiados en las Jornadas de Lípidos 2012 de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (UBA).

Introducción: La linaza es fuente de fibra, lignanos y ácido α-linolénico, componentes que la hacen muy útil para disminuir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Objetivo: Determinar el efecto del consumo de linaza (Linum usitatissimum) sobre el perfil lipídico de adultos aparentemente sanos en Lima en el 2011. Metodología: Estudio cuasiexperimental en el que cuarenta voluntarios de ambos sexos, de 30 a 55 años de edad, fueron reclutados mediante un muestreo no probabilístico de voluntarios. El grupo experimental consumió 40g de linaza al día por cuatro semanas, y el grupo control consumió salvado de trigo. Se les midió el perfil lipídico e IMC basales y a la cuarta semana. Los resultados fueron analizados mediante la prueba t de student para datos apareados y no apareados y la prueba U de Mann-Whitney. Resultados: Se encontró una reducción de 1% del colesterol total, de menos de 1% del colesterol de LDL, de 4,6% del colesterol de HDL y de 17,6% de triglicéridos con el consumo de linaza. Con el consumo de salvado de trigo se aumentó el colesterol total en 2,3%, el colesterol de LDL en 5,5%, los triglicéridos en 6,3%, y redujo el colesterol de HDL en 24%. Estos resultados no fueron estadísticamente significativos (p>0,05). No hubo cambio significativo del IMC en ninguno de los grupos. Conclusiones: El consumo de linaza no mostró beneficio sobre el perfil lipídico en adultos aparentemente sanos. Palabras clave: linaza, perfil lipídico, adultos, salvado de trigo. / Introduction: Flaxseed is source of fiber, lignans and α linolenic acid, compounds that make it very useful to reduce cardiovascular disease risk. Objective: Determining the effect of flaxseed (Linum usitatissimum) intake over the lipid profile of apparently healthy adults in Lima in 2011. Methodology: Cuasiexperimental study where forty volunteers both sexes, of 30 to 55 years old. Were recruited through a volunteer non probability sampling. The experimental group consumed 40g of flaxseed per day during four weeks, and the control group consumed wheat bran. Basal and after the four week lipid profile and BMI were measured. The results were analyzed through unpaired T student test and U de Mann-Whitney Test. Results: Flaxseed group had a reduction of 1% of total cholesterol, less than 1% of LDL cholesterol, 4,6% of HDL cholesterol and 17,6% of triglycerides. Wheat bran group had an increase of 2,3% of total cholesterol, 5,5% of LDL cholesterol and 6,3% of triglycerides and reduced 24% of HDL cholesterol. These results were not statistically significant (p>0,05). There was not a significant change in BMI in any of the groups. Conclusions: Flaxseed intake not improved lipid profile in apparently healthy adults. Key words: Flaxseed, lipid profile, adults, wheat bran.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa cómo la exposición a hipoxia hipobárica intermitente simulada en cámara hipobárica en adultos mayores de 18 años sanos y con presencia de enfermedades relacionadas a desórdenes metabólicos genera una variación del perfil lipídico, con la consiguiente mejora de los pacientes. La muestra está conformada por 25 pacientes divididos en 3 grupos diferenciados de 8 pacientes sanos, 5 pacientes obsesos y 12 pacientes diabéticos tipo 2, seleccionados al azar, a los cuales no se les controlo ni la dieta, ni la medicación. A los tres grupos se les sometió a 1 sesión semanal por 4 semanas de Hipoxia Hipobárica Intermitente en Cámara Hipobárica simulando una altura de 3200 m.s.n.m. por 3 horas (una hora de ascenso, una hora de mantenimiento en altura y una hora de descenso), El perfil lipídico, glicemia se evaluaron al inicio del estudio y una vez concluido el mismo. El colesterol total se redujo en más del 8 % en los pacientes sanos y obesos frente al aumento del 11 % en los diabéticos tipo 2. Cambios similares se encontraron para el LDLColesterol donde disminuyo en 2 y 8 % en los sanos y obesos respectivamente, esto en oposición a que se elevó en los diabéticos en 18 %. Los niveles de HDL-Colesterol disminuyeron en más de 0.23 % para todos los grupos estudiados. Finalmente los Triglicéridos disminuyeron en los pacientes sanos y obesos en 6 y 8 % respectivamente, a diferencia del aumento del 20 % en pacientes diabéticos. Presentando significancia estadística las diferencias encontradas en las medias de Triglicéridos de los pacientes obesos (p = 0.047). / Tesis