Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En el sistema nervioso, la transmisión del impulso nervioso entre neuronas se efectúa a través de la sinapsis. Éstas pueden ser de dos tipo, eléctricas y químicas. En estas últimas existen diversas proteínas que se asocian a los receptores de neurotransmisores, las que intervienen en su biosíntesis, transporte, anclaje y modulación de su actividad. Este trabajo se centró en el estudio de una nueva proteína llama Marlin-2, identificada a través de análisis comparativos entre la estructura primaria de la proteína Marlin-1 y las secuencias depositadas en las bases de datos. Marlin-1 (multiplt alpahelices and RNA linker protein), es una proteína que se asocia directamente a la subunidad R1 del receptor de neurotransmisores GABAB e intervendría en su expresión y función. La hipótesis planteada en este trabajo es la siguiente: la homología entre Marli-1 y Marlin-2 define la relación de esta última con compartimientos subcelulares, dominios neuronales y su interacción con el receptor de GABAB. Para verificar esta hipótesis elegimos una combinación de técnicas bioquímicas y microscópicas en modelos de líneas celulares mamíferas y neuronas de cultivo primario de ratas. Nuestros resultados indican que Marlin-2 y Marlin-1 poseen un alto porcentaje de identidad en sus estructuras primarias y que sus dominios estructurales se encuentran altamente conservados, especialmente los involucrados en interacciones proteicas. Además demostramos que en líneas celulares Marlin-2 se distribuye en núcleo y citoplasma y que presentan un patrón granular, predominantemente citoplasmático. Por otra parte, en neuronas transfectadas con Marlin-2, esta proteína se distribuye en el soma y dendritas proximales, presentado un patrón granular, similar al de Marlin-1 endógena. También hemos demostrado la interacción entre Marlin-1 y Marlin-2 mediante análisis de bioimagen y co-inmunoprecipitación en líneas celulares. En base a estos resultados y a las herramientas desarrolladas en este trabajo, en el futuro se logrará conocer en mayor profundidad el rol de esta proteína en el sistema nervioso

El cerebro humano está formado por una compleja red de células nerviosas que utilizan diversas señales para comunicarse entre ellas. La propagación de señales tiene lugar en la sinapsis química en donde el neurotransmisor liberado por la neurona presináptica interacciona con un receptor postsináptico específico. Los canales iónicos activados por ligandos (LGIC) median respuestas rápidas en dichas sinapsis. El rol vital de los mismos es convertir una señal química en un impulso eléctrico. Para generar una respuesta adecuada los LGIC deben ser capaces de activarse en presencia del neurotransmisor y cerrarse en su ausencia. Estos receptores están involucrados en el aprendizaje, la memoria, el movimiento y en enfermedades genéticas, y son blancos de numerosos fármacos. Los receptores pentaméricos Cys-loop son LGIC que intervienen en sinapsis químicas rápidas. La duración, amplitud y frecuencia de una respuesta sináptica es gobernada por la cinética de apertura, cierre y desensibilización del canal. Los mecanismos moleculares de estos procesos no se conocen todavía. Los receptores poseen un dominio extracelular, unidor del neurotransmisor, y una región transmembranal, formadora del poro iónico. Uno de los objetivos de este trabajo de Tesis fue dilucidar el rol funcional de la interfase entre ambos dominios. Con este fin utilizamos receptores homopentaméricos con interfases con secuencias de 7 y 5-HT3A en los diferentes loops que las componen y evaluamos los tiempos de apertura y desensibilización de los receptores formados. Esta estrategia nos permitió determinar la contribución de cada loop y las consecuencias funcionales de la interacción entre ellos. Determinamos que la interacción entre los distintos loops de la interfase permite el acoplamiento de la unión del agonista con la apertura del poro iónico y gobierna la cinética de apertura y desensibilización de los receptores Cys-loop, controlando de esta manera la duración de la respuesta sináptica y el período refractario. Los nematodos parásitos tienen importancia médica y veterinaria ya que afectan la salud del hombre y del animal. Los fármacos antihelmínticos son esenciales para controlar los nematodos parásitos. Los agentes levamisol, pirantel, morantel y oxantel, ejercen su acción actuando sobre los nAChRs de los helmintos. En los últimos años se ha demostrado que la acción de estos fármacos depende del subtipo de receptor nACh. Exploramos las bases estructurales de dichas diferencias estudiando cómo estos agentes activan a los receptores nACh muscular y 7 de mamífero utilizando la técnica electrofisiológica de Patch-clamp. Encontramos que todas estas drogas son agonistas débiles del receptor nACh muscular adulto de mamífero. Por el contrario, pirantel y morantel cambian su comportamiento a agonistas completos y más potentes que la ACh en el receptor 7. Determinamos que la posición 57, localizada en el lado complementario del sitio de unión de agonistas, es responsable de la diferente activación de los receptores nACh muscular y 7 por morantel y pirantel. Esta posición no altera la activación de ACh o de los fármacos oxantel y levamisol. El conocimiento de la activación de los nAChRs por antihelmínticos contribuirá al diseño de terapias más selectivas contra los parásitos y a comprender como éstos desarrollan resistencia a estos fármacos. / The human brain is a vast and complicated network, where billions of nerve cells use signals to communicate with each other. At chemical synapses, neurotransmitters are released from the presynaptic cell. They interact with ligand-gated ion channels (LGIC) at the postsynaptic cell that convert signals from chemical to electrical in less than one millisecond. The channels close as the neurotransmitter dissociates to terminate the synaptic event. These receptors are involved in learning, memory, movement and disease processes, and are targets for clinically relevant drugs. The pentameric Cys-loop receptors are LGIC involved in fast chemical synapsis. Following the neurotransmitter release and binding to Cys-loop receptors, the post-synaptic response is governed by the kinetics of channel activation, deactivation and desensitization. The molecular mechanisms of these processes are still unknown. Cys-loop receptors have an extracellular domain, which contains the agonist binding sites, and a transmembrane domain where the ion pore is located. One of the goals of this Thesis was to determine the functional role of the interfacial region between extracellular and transmembrane domains. We generated homomeric chimeric receptors carrying sequences of 7 or 5-HT3A at the different loops of the interface and evaluated the open channel lifetime and rate of desensitization. This strategy allowed us to determine the functional contribution of each loop and the consecuences of structural mismatching among them. We concluded that the network of loops at the binding-pore interface of homomeric receptors is essential for coupling agonist binding to channel opening and also for dictating the kinetics of gating and desensitization. Thus, this region controls the duration of the refractory period and the synaptic response. Parasitic nematodes are of medical and veterinary importance, affecting human and animal health. Anthelmintic drugs are essential to control nematode parasites. These agents, such as levamisol, pyrantel, morantel and oxantel, exert their action at nAChRs in nerve and muscle of nematodes. In the last years, it has been demonstrated that the actions of these drugs depend on nAChR subtypes. To understand the structural basis of the differential activation of anthelmintics among nAChR subtypes, we studied the activation of mammalian muscle and 7 nAChRs by these agents at the single-channel and macroscopic-current levels. We showed that anthelminitic agents are low efficacious agonists of mammalian muscle AChRs. By contrast, morantel and pyrantel are high-efficacious and more potent agonists than ACh of 7 receptor. Also, we determined that position 57, located at the complementary face of the binding site, is a main determinant of the differential activation of mammalian muscle and 7 nAChRs by morantel and pyrantel. This position is not involved in ACh, oxantel or levamisol activation. These results provide new information for further progress in drug design and help to understand how parasites develop resistance to these drugs.

Los pesticidas organoclorados (POCs) son compuestos altamente persistentes en el medio ambiente y dada su capacidad de acumularse en los tejidos grasos animales se biomagnifican a lo largo de la cadena trófica. Estos contaminantes ambientales son antagonistas del receptor GABAA, lo que les confiere sus propiedades convulsivas tras una intoxicación aguda. En este estudio hemos planteado la hipótesis de que la exposición prolongada al pesticida dieldrín en cultivos primarios de neuronas corticales podría alterar la funcionalidad, expresión o localización de los receptores de glutamato como consecuencia del bloqueo mantenido del receptor GABAA. La exposición durante 6 días in vitro a una concentración no citotóxica (60nM) de dieldrín produjo la internalización de los receptores NMDA que contienen la subunidad NR2B (NR1/NR2B), pero no NR2A, y disminuyó también los niveles del receptor metabotrópico de glutamato 5 (mGluR5). El tratamiento con los neuroesteroides estradiol o alopregnanolona previno la reducción de los receptores NR1/NR2B en la membrana inducida por el dieldrín. Además, la exposición prolongada a 200nM dieldrin disminuyó la expresión génica de NR2A, efecto que fue revertido sólo por alopregnanolona. En neuronas corticales maduras, el dieldrín causó el truncamiento de NR2B mediado por las calpaínas y redujo la interacción de ésta subunidad con SAP102, efecto de nuevo prevenido por alopregnanolona. A pesar de que ambas hormonas restauraron la funcionalidad del receptor NMDA, alopregnanolona (pero no estradiol) revirtió tanto la inhibición del receptor GABAA como la muerte neuronal causadas por el dieldrín. Posteriormente, estudiamos los efectos de dieldrín, endosulfán y lindano sobre los receptores de estrógenos (ER) en cultivos primarios de neuronas corticales y de células granulares de cerebelo (CGC). Todos ellos inhibieron la unión de [3H]-estradiol en ambos tipos neuronales, siendo el dieldrín en CGC aquel con mayor afinidad sobre el ER. Además, dieldrín y endosulfán causaron un aumento de la fosforilación de Akt en neuronas corticales, efecto que fue inhibido por el antagonista de ERβ, PHTPP. En cambio, la fosforilación de Akt y ERK1/2 inducida por dieldrín en CGC fue mediada por la activación múltiple de ERα, ERβ, y GPR30. El lindano inhibió el efecto del estradiol sobre estas kinasas. En neuronas corticales, los tres pesticidas activaron ERK1/2 a través de los receptores GABAA y de glutamato. La exposición a largo plazo a los POCs redujo los niveles de ERα pero no de ERβ. Finalmente, comparamos la neurotoxicidad de los POCs en CGC y neuronas corticales. El dieldrín y el endosulfán fueron más tóxicos que el lindano en ambos cultivos. Se observó también que las CGC maduras son más sensibles que las neuronas corticales a la neurotoxicidad inducida por los POCs. Por el contrario, las neuronas corticales inmaduras, especialmente las glutamatérgicas, fueron más susceptibles a la exposición prolongada a concentraciones bajas de estos pesticidas. Además, la fosforilación de Akt y ERK1/2 se vio disminuida tras 24 horas de exposición a dieldrín o endosulfan en CGC. El tratamiento con estradiol e insulina previno la muerte apoptótica mediada por caspasa-3 causada por estos pesticidas a través de la activación conjunta de ERK1/2 y Akt. Este trabajo confirma que el bloqueo permanente del receptor GABAA por dieldrín provoca una reducción de la neurotransmisión glutamatérgica, lo que podría afectar a funciones cerebrales como la memoria y el aprendizaje. Además, los POCs son capaces de mimetizar o inhibir algunas de las acciones no genómicas del estradiol, lo que puede interferir con la señalización fisiológica de esta hormona en el cerebro. Este estudio revela también la susceptibilidad específica de las neuronas glutamatérgicas frente a la exposición prolongada a estos contaminantes y desvela los mecanismos moleculares por los cuales los POCs producen la muerte de estas neuronas.