NORONHA, Emmanuelle Coelho. Ação de drogas agonistas e antagonistas dos sistemas colinérgico e topaminérgicos : estudo comportamental e neuroquímico em corpo estriado de rato. 2005. 168 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-22T13:59:30Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_ecnoronha.pdf: 1191256 bytes, checksum: 22a3cf67a29cae361ffc70d8d192dcca (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-26T11:51:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_ecnoronha.pdf: 1191256 bytes, checksum: 22a3cf67a29cae361ffc70d8d192dcca (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-26T11:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_ecnoronha.pdf: 1191256 bytes, checksum: 22a3cf67a29cae361ffc70d8d192dcca (MD5) Previous issue date: 2005 / In the study, the interaction between the dopaminergic and cholinergic systems through the study of behavioral (open field and catalepsy) and neurochemical (density of dopaminergic receptor (D1 and D2-like) and muscarinic (M1+M2-like)) effect in striatum rat was evaluated. The following drugs were used: mazindol (indirect dopaminergic agonist), apomorphine (D1-like and D2-like dopaminergic agonist), pilocarpine (M1-like muscarnic aginist), carbachol (M-2like agonist muscarinc), pirenzepine (M1-like antagonist muscarinic), atropine (non-selective M1 and M2 antagonist muscarinic), clozapina(non-typical neuroleptic). The results showed that the pimozida and carbachol, alone or associated, caused increase in the cataleptic response and reduction in the motor activity. The mazindol also increased the motor activity. In small dosage, the carbachol and mazindol increased the density of D1-like receptors. Isolated, the pimozida and atropine increased the density of the D1-like receptors in striatum whereas the atropine caused a reduction of D2-like receptors and upregulation of muscarinic receptors. This work suggests a relationship, between muscarinc receptors M1 and M2 and dopaminergic receptors D1 and D2, and that this relationship can occur in a positive and negative manner, depending on the selectivity and the dose of the used drug. / No presente trabalho, foi avaliado a interação entre os sistemas dopaminérgico e colinérgico através do estudo dos efeitos comportamentais (campo aberto e catalepsia) e neuroquímicos (densidade de receptores dopaminérgicos (D1 e D2-símile) e muscarínicos (M1+M2-símile) em corpo estriado de rato. As seguintes drogas foram utilizadas: mazindol (agonista dopaminérgico indireto), apomorfina (agonista dopaminérgico D1-símile e D2-símile), pimozida (antagonista dopaminérgico D2-símile), SCH 23390 (antagonista dopaminérgico D1-símile), pilocarpina (agonista muscarínico M1-símile), carbacol (agonista muscarínico M2-símile), pirenzepina (antagonista muscarínico M1-símile), atropina (antagonista muscarínico M1 e M2 não seletivo), clozapina (neuroléptico atípico). Os resultados mostraram que a pimozida e o carbacol, sozinhos ou associados, causaram um aumento da resposta cataléptica e uma diminuição da atividade locomotora. O mazindol também aumentou a atividade locomotora. Carbacol, nas menores doses, e o mazindol aumentaram a densidade de receptores D1-símile. A pimozida e a atropina, isoladamente, aumentaram a densidade de receptores D1-símile no corpo estriado enquanto que a atropina causou uma diminuição dos receptores D2-símile e uma upregulation dos receptores muscarínicos. O mazindol aumentou o binding de 3H-NMS no corpo estriado. O presente trabalho sugere, de maneira geral, que existe uma relação entre os receptores muscarínicos M1 e M2 com os receptores dopaminérgicos D1 e D2, sendo que esta relação pode ocorrer de maneira positiva ou negativa, dependendo da seletividade e da dose das drogas utilizadas.

PATROCÍNIO, Manoel Cláudio Azevedo. Efeitos farmacológicos do telocinobufagin, um bufadienolídeo oriundo das glândulas parotóides do Bufo paracnemis : estudo comparativo com o anestésico local bupivacaína. 2004. 158 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2004. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-14T13:02:27Z No. of bitstreams: 1 2004_tese_mcapatrocínio.pdf: 1111207 bytes, checksum: c57dabefef3c4d8d85df977f2488c78b (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-14T16:35:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2004_tese_mcapatrocínio.pdf: 1111207 bytes, checksum: c57dabefef3c4d8d85df977f2488c78b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-14T16:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2004_tese_mcapatrocínio.pdf: 1111207 bytes, checksum: c57dabefef3c4d8d85df977f2488c78b (MD5) Previous issue date: 2004 / The pharmacological effects of telocinobufagin (TCB), a bufadienolide extracted from Bufo paracnemis parotoid glands by HPLC, were compared to that induced by bupivacaine (BUPI). On guinea-pig isolated ileum, TCB (10-8 to 10-4 M) inhibited both, the electrical field stimulation (EFS)-induced contraction (with a value of 0.9 ± 0.9 % of the control response at 6x10-4 M), and the contractions elicited by ACh, in a concentration-dependent manner. BUPI (10-7 to 10-3 M) also inhibited both, the EFS- and the ACh-induced contractions on guinea-pig isolated ileum, in a concentration-dependent manner. On rat isolated sciatic nerve, TCB (1 mM) reduced the compound action potential (CAP) peak-to-peak amplitude (PPA) to 64.9±7.2 % and 12.9±4.4 % of the control amplitude after 15 min and 30 min, respectively; withdrawal of telocinobufagin reversed to 83.2±17.5% after 45 min. TCB reduced the CAP conduction velocity (CV) to 15.0±15.0 % of the control after 30 min; wash reversed to 78.7±7.2 % of the control. BUPI (1 mM) inhibited the CAP PPA to 46.7±14,4 % and 11.8.±6.5 % of the control after 15 min and 30 min, respectively; it recovered partially to 29.7±8.3 % after 45 min of wash. BUPI inhibited the CAP CV to 17.4±11.2 % of the control after 30 min; it recovered partially to 44.8±14.5 % after 45 min of wash. On rat isolated atrium, TCB (10-6 to 10-4 M) did not alter the spontaneous inotropism, which was abolished by BUPI. Thus, TCB showed a reversible local anesthetic action, similar to BUPI, however, without cardiac toxicity in vitro. This study shows perspectives to research of new molecules for local anesthetic activity with therapeutic interest. / Foram avaliados os efeitos do bufadienolídeo telocinobufagin (TCB), obtido das glândulas parotóides do Bufo paracnemis por cromatografia líquida de alta eficiência, comparando-os com os do anestésico local bupivacaína (BUPI). TCB (10-8 a 6x10-4 M) inibiu, de modo concentração-dependente, as contrações induzidas por estimulação por campo elétrico (ECE) em íleo isolado de cobaio, cujo valor foi 0,9±0,9 % da resposta controle, na concentração de 6x10-4 M. Da mesma forma, TCB (10-6 a 10-4 M) inibiu, as contrações induzidas pela ACh. BUPI (10-7 - 10-3 M) inibiu, de modo concentração-dependente, tanto as contrações induzidas por ECE quanto as induzidas por ACh. Em nervo ciático isolado de rato, a amplitude pico-a-pico (APP) do potencial de ação composto (PAC) caiu para 64,9±7,2 e 12,9±4,4 % do controle, após 15 e 30 min com 1 mM TCB, respectivamente, retornando para 83,2±17,5 % lavando-se o nervo com Locke por 45 min. Nas mesmas condições, a velocidade de condução (VC) do PAC caiu para 15,0±15,0 % da controle, após 30 min; sendo recuperada para 78,7±7,2 % após 45 min da retirada do TCB. BUPI (1mM) diminuiu tanto a APP do PAC para 46,7±14,4 % e 11,8±6,5 % da controle, após 15 e 30 min, respectivamente, quanto a VC para 17,4±11,2 % da controle, após 30 min; após 45 min da lavagem reverteu parcialmente a APP e a VC para 29,7±8,3 e 44,8±14,5 % da obtida no controle, respectivamente. Em átrio isolado de rato, TCB (10-6 a 10-4M) não alterou o inotropismo espontâneo, o que foi reduzido pela BUPI (10-4 M). Portanto, TCB possui propriedades anestésicas locais reversíveis semelhantes à BUPI, sem apresentar, no entanto, sinais de toxicidade cardíaca in vitro, abrindo perspectivas para busca de novas moléculas com ação anestésica local com potencial interesse terapêutico.

Orientadores: Alba Regina Monteiro Souza Brito, Regina Celia Spadari-Bratfisch / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T11:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marinho_EduardoAryVillela_M.pdf: 3614003 bytes, checksum: 9257f5def2cccc168c60369b0461d4d5 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho foram investigadas as respostas da camada muscular interna do dueto deferente humano a agonistas colinérgicos e adrenérgicos na ausência e na presença de antagonistas. Os duetos foram obtidos de homens saudáveis com idade entre 25 e 45 anos, em cirurgia de vasectomia, e imediatamente colocados em solução de Krebs-Henseleit, onde foram mantidos sob refrigeração, até o momento da realização do experimento. Os experimentos ocorreram no máximo 48 horas após a cirurgia. Os duetos foram preparados de três maneiras distintas: tiras em espiral, anéis ou cortes transversais alternados, para definição da preparação mais sensível, a qual seria utilizada nos experimentos subseqüentes. Foi definido anteriormente que seria mais sensível aquela preparação que mostrasse maior resposta máxima e maior valor pD2 para a noradrenalina. Após a definição da técnica, os duetos foram submetidos à ação de agonistas colinérgicos. Não foram obtidas respostas contráteis a estes agonistas. Em seguida foram realizadas curvas dose-efeito a agonistas adrenérgicos, com os quais foram obtidas respostas que permitiram o estudo da população de adreno-receptores, assim como estudos dos sistemas de metabolização de catecolaminas nesta região do tecido. Para o estudo das populações específicas de receptores, foram utilizados agonistas e antagonistas seletivos. Os resultados obtidos permitiram concluir que: preparação mais sensível e, portanto, a ser utilizada no estudo da contração da camada muscular circular interna do dueto deferente humano, é a preparação em espiral; a preparação em estudo é insensível a agonistas colinérgicos, sugerindo ausência ou população restrita de receptores na região estudada; a contração da camada circular é fundamentalmente adrenérgica, verificando-se principalmente a presença de receptores do tipo a1; os sistemas de metabolização de catecolaminas são ativos, atuando de maneIra conjunta (recaptação neuronal ecaptação extraneuronal); estudos funcionais permitiram ainda sugerir que parte da resposta pode estar associada a receptores do sub-tipo a1a, os quais utilizam o cálcio extracelular como segundo mensageiro / Abstract: The objective of this work was to investigate the response of the circular smooth muscle layer of the human vas deferens to cholinergic and adrenergic agonists in the absence and in the presence of antagonists. The vas deferens were obtained from 25 to 45 years old men in vasectomy surgeries. Tissues were kept in Krebs-Henseleit solution, under refrigeration, for no longer than 48 hours. Vas deferens were prepared in three different ways: spiral strips, rings or alternate transversal cuts, in order to determine the most sensitive preparation for the subsequent experiments. The tissues were exposed to cholinergic agonists but no contractile responses were observed. Tissue exposure to adrenergic agonists resulted in correspondent dose-effect curves, obtained in the absence or in the presence of selective antagonists. The results indicated that: the most sensitive preparation was the spiral strip; the contraction of the circular smooth inner layer is mostly adrenergic with major presence of the a1 adrenoceptor; functional studies suggested that a significant part of the response can be associated to a1a adrenoceptors / Mestrado / Fisiologia e Biofisica / Ciencias Biologicas

Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T11:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Minatel_Elaine_D.pdf: 2866714 bytes, checksum: 4b1a22830600fc8a3f80c2e327e07ce0 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As junções neuromusculares (JNM) dos vertebrados, inicialmente polinervadas, tomam-se monoinervadas em um processo denominado eliminação sináptica. Os mecanismos envolvidos neste processo ainda são pouco conhecidos, sendo uma das possibilidades a de que mudanças no nível das moléculas da membrana pós-sináptica poderiam levar a remoção dos terminais nervosos em excesso. Neste sentido, a JNM distrófica se toma um modelo interessante para o estudo dos mecanismos envolvidos na eliminação sináptica, uma vez que as fibras distróficas não expressam distrofina e apresentam redução de moléculas do complexo distrofina-glicoproteina, complexo este que faz parte do citoesqueleto pós-sináptico e que possivelmente está envolvido na estabilização dos receptores de acetilcolina (AChRs). Desta forma, no presente trabalho verificamos se a eliminação sináptica e a distribuição dos receptores de acetilcolina, observados durante o desenvolvimento pós-natal, estão alterados na fibra deficiente de distrofina. Os AChRs e os terminais nervosos do músculo estemomastóide de camundongos mdx e controle (C57BL/1O) foram marcados, respectivamente, com rodamina-a.-bungarotoxina e anticorpo anti-neurofilamento. Através da microscopia confocal, observamos que 7 dias após o nascimento a maioria das JNMs do camundongo mdx se encontravam monoinervadas (86,7% - n=200), enquanto a mesma observação foi feita em 41,4% no controle (n=200). Consistente com este fato, no mesmo período, a presença de placas perfuradas é mais fTequente no mdx (18,6%) do que no controle (7,3%). No final da segunda semana pósnatal, todas as JNMs se encontravam monoinervadas (100% mdx e 94,7% controle, n=200 para cada grupo) e os AChRs apresentavam o padrão de distribuição adulto. No camundongo mdx, a presença de AChRs distribuídos em pequenas ilhas foi observada no período de 21 dias pós-natal em 13,3% das JNM, indicando a presença de fibras musculares regeneradas. Nossos resultados demonstram que a eliminação sináptica ocorre mais cedo nas fibras musculares distróficas quando comparada ao de um animal controle, sugerindo assim que a estabilização da fibra muscular pela distrofina ou pelo complexo distrofinaglicoproteínas normal é necessário para o curso da eliminação sináptica em tempo normal / Abstract: The vertebrate neuromuscular junction goes trom multiple to monoinervated during early postnatal life in a process calIed synapse elimination. The mechanisms underlying this process are unknown but one possibility would be that changes at in the molecular level in the postsynaptic cell lead to the removal of the overlying nerve terminal. The mdx mice show a deficiency of dystrophin and associated proteins, which are part of the postsynaptic cytoskeleton and possibly involved in acetylcholine receptors (AChRs) stabilization. In the study, we used rhodamine-a-bungarotoxin and anti-neurofilament-IgG-FITC to stain AChRs and nerve terminals of the sternomastoid muscle, during early postnatal development of mdx and control C57BL/lO mice. Using fluorescence confocal microscopy, we observed that 7 days after birth, 86,7% of the mdx endplates were monoinervated (n=200) while the same observation was made in 41,4% of the controls (n=200). Consistent with this is the fact that, at this time, perforated plaques were seen more trequent1y in mdx (18,6%) than controls (7,3%). By the end of the second postnatal week, all the endplates were monoinervated (100% mdx and 94,7% controls, n=200 for each group) and AchRs had attained the branched-pattern distribution of adults. In mdx mice, breaking down of receptors into islands, as observed in adult mdx, were seen 21 days after birth in 13,3% of the junctions, indicating the presence of regenerated muscle fibers. These results show that synapse elimination takes place earlier in dystrophin-deficient muscle fibers of the mdx mice, suggesting that stabilization of muscle fiber by dystrophin or a nonnal cytoskeleton complex is required for the nonnal time course of synapse elimination / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T04:25:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_AlessandraOliveira_M.pdf: 2395523 bytes, checksum: d2553e94afd3c2f15c7cf07af738bf0f (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Os camundongos distróficos da linhagem mdx apresentam ausência de distrofina e ciclos de degeneração-regeneração muscular, sendo o modelo experimental usado para estudar a distrofia muscular. As principais alterações na fibra muscular destes animais são observadas na junção neuromuscular (JNM), em que as dobras juncionais são escassas e pouco desenvolvidas e os receptores de acetilcolina (AChRs) se apresentam em pequenos aglomerados que contrastam com a distribuição em braços contínuos típicos de animais normais. O terminal nervoso contém, dentre outras moléculas, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), que auxilia na manutenção da alta densidade dos AChRs no topo das dobras juncionais. Uma vez que a falta da distrofina parece não ser o único fator responsável pelas alterações causadas nos AChRs, o objetivo do presente trabalho foi investigar a distribuição do CGRP nas JNM distróficas de camundongos da linhagem mdx. Foram utilizados animais distróficos mdx e animais normais C57B1/1O como controle. Os animais utilizados eram de ambos os sexos, com 3 a 4 meses de idade. Os músculos esternomastóideos (STNs) foram marcados com rodamina-alfa-bungarotoxina para observação dos AChRs e o CGRP foi marcado com os anti-corpos anti-CGRP-IgG-FITC (Sigma). Através da microscopia confocal de fluorescência observamos que 81% das junções controle estavam positivas à marcação do CGRP, enquanto que nos animais mdx, 34% das junções apresentavam marcação do CGRP. Sugerimos que o CGRP, nos mdx, não se acoplaria corretamente ao complexo de glicoproteínas, por este estar alterado devido à ausência da distrofina e que sua quantidade reduzida deve ser resultado de alteração na produção, transporte e/ou ligação deste peptídeo no complexo de glicoproteínas, o que poderia contribuir, pelo menos em parte, para as alterações de distribuição dos receptores de acetilcolina tipicamente observadas nos animais mdx / Abstract: The aim of the present investigation was to study the distribution of the calcitonin gene related peptide (CGRP) at the neuromuscular junction (nmj) of mdx mice. Mutant mdx mice carry a point mutation on the X-chromosome and have a profound deficiency of dystrophin, for this they are the experimental model to study muscular dystrophy. We used the sternomastoid muscle (STN) of adult (3-4 months) mdx mice and control C57Bl/1O mice. The muscles were removed, labelled with rhodamin-abungarotoxin for acetylcholine receptors (AChRs) observation and anti-CGRP-IgG-FITC to label CGRP. A BioRad laser fluorescence confocal system (MRC 1024 UV) mounted on an Axiovertt 100 Zeiss inverted microscope equipped with an Ar-Kr and UV lasers was used. We found that fewer dystrophic nmjs showed CGRP labeling, when compared to controls. In controls, the label was seen in intramuscular nerve branches and in nerve terminals covering the AChRs branches. In mdx mice, intramuscular nerve branches were rarely seen and CGRP staining colocalized with AChRs in a more diffuse pattern. AChRs distribution in mdx mice was disrupted, as typically seen in dystrophin-deficient fibers. Receptors seemed to be usually brighter than controls, suggesting an increase in AChRs density. These results suggest that CGRP production and or release are under different control in dystrophic and normal muscles and this may lead to changes in AChRs turnover or distribution seen in mdx mice / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Carlos Roque Duarte Correia / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:34:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barreto_RicardodeLima_M.pdf: 3288745 bytes, checksum: 00dd19e2fc9ebd12556b855bcd2acbe6 (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado / Mestre em Química

Orientador : Oswaldo Vital Brazil / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-15T09:40:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neder_AntonioCarlos_D.pdf: 11258905 bytes, checksum: 86e01509fecf6b5aa6f007dadc438110 (MD5) Previous issue date: 1966 / Resumo: A peçonha de Tityus serrulatus, quando incubada com o diafragma do rato, o íleo da cabaia ou ganglio celiaco do gato, é capaz de liberar, desses tecidos, um principio hipotensor que foi identificado como sendo um éster da colina, com muita probabilidade, a própria acetilcolina. Esta substancia provem das terminações nervosas colinergica, pois ela não apareceu quando se empregaram estruturas desenervadas...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Odontologia

La superfamilia de canales iónicos activados por ligandos (en inglés ligand gated ion channels, LGIC) incluye al receptor de acetilcolina nicotínico (AChR, neuronal y muscular), los receptores del ácido γ-amino butírico (GABAAR), el receptor de glicina (GlyR) y el subtipo 3 de los receptores de serotonina (5-HTR3). Dentro de esta superfamilia, el AChR es uno de los receptores mejor caracterizados y constituye el prototipo de los LGIC. El AChR muscular es un oligómero heteropentamérico compuesto por dos subunidades α y tres subunidades adicionales β, γ y δ, en una estequiometría α2βγδ en el AChR muscular fetal, mientras que en el adulto la subunidad γ es reemplazada por la subunidad ε. Este receptor se encuentra en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular. La unión de su agonista natural, la acetilcolina (ACh) causa la activación del AChR, provocando un cambio conformacional en la proteína, con rápida apertura del canal y la entrada de iones sodio al interior celular. Debido a que el AChR es una proteína integral de membrana plasmática, sus dominios hidrofóbicos transmembrana se hallan en contacto con los lípidos presentes en la bicapa. Estos lípidos interaccionan con diversos dominios del receptor modulando su funcionalidad. En esta Tesis estudiamos los efectos promovidos por alteraciones en los niveles de lípidos celulares tales como el colesterol, la esfingomielina o ceramidas, sobre la síntesis y el tráfico del AChR, así como también sobre su afinidad por ligandos y estabilidad en la membrana plasmática. Todos estos parámetros fueron evaluados utilizando como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular desarrollada en nuestro laboratorio que expresa en forma heteróloga estable el AChR de tipo muscular adulto (α2βδε). En primer lugar, evaluamos los efectos de la depleción metabólica crónica del colesterol por la droga Mevinolina, potente inhibidor de la enzima microsomal 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa, enzima limitante en la biosíntesis de colesterol. Se logró determinar que cuando los niveles de colesterol celular son disminuidos por acción de esta droga, el número de AChRs presentes en la membrana plasmática de células CHO-K1/A5 sufre una drástica disminución (46%), con un aumento concomitante en el número de receptores intracelulares. Dichas variaciones se produjeron por inhibición del tráfico exocítico de la proteína con la consecuente retención del AChR a nivel del TGN. De igual modo, observamos que en condiciones controles el AChR se localiza parcialmente en membranas resistentes a detergentes (DRMs o balsas lipídicas) de retículo endoplasmático y Golgi, y que la depleción del colesterol afecta esta distribución, disminuyendo la proporción de AChRs presentes en dichos dominios de membrana. En conjunto, estos resultados nos permitieron concluir que el colesterol modula el transporte de nuevos AChRs hacia la superficie celular, a través de la asociación de dichos receptores con plataformas lipídicas enriquecidas en colesterol. En segundo lugar, estudiamos los efectos ejercidos por las ceramidas, precursoras en la síntesis de esfingolípidos, sobre diferentes propiedades del AChR. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de ceramidas de corta o larga cadena, o bien se expusieron a la incubación con esfingomielinasa para evaluar los efectos promovidos por la generación de ceramidas endógenas. Se logró demostrar la efectividad de las ceramidas en modular no sólo el tráfico del AChR sino también su afinidad por ligandos. En cuanto al tráfico del receptor, se demostró que las ceramidas ejercen una modulación dual de este proceso, aumentando o disminuyendo el número de AChRs en la superficie celular, dependiendo de la concentración de lípido utilizada. Con respecto a la afinidad del AChR por el ligando αBTX, se observó un aumento de la misma cuando las células son incubadas a altas concentraciones (25 ó 37.5 μM) de ceramidas, mientras que a bajas concentraciones del lípido (5 μM) no se produjeron tales cambios. Finalmente, se determinó que la generación de ceramidas endógenas por tratamiento con esfingomielinasa también fue efectiva en promover la disminución de los niveles de AChR en la membrana celular, a través del aumento en la tasa de endocitosis del receptor. / The ligand-gated ion channel superfamily (LGIC) comprises the nicotinic acetylcholine receptor (AChR, neuronal and muscle-types), the γ-amino butyric acid receptor (GABAAR), the glycine receptor (GlyR) and the serotonin receptor subtype 3 (5-HTR3). Within this superfamily, the AChR is the best characterized and is considered as the prototype LGIC. The muscle AChR is an heteropentamer composed of two α subunits and three additional subunits (β, γ, δ) in the stoichiometry α2βγδ (in the foetal AChR) whereas in the adult receptor form the γ subunit is replaced with the ε. This receptor is present at the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction. The binding of its natural agonist, acetylcholine (ACh), leads to the activation of the AChR, causing a conformational change in the protein, with the rapid aperture of the channel and the entry of sodium ions inside the cell. On account of the fact that the AChR is an integral membrane protein, its hydrophobic transmembrane domains are in close contact with the bilayer lipids. These lipids interact with various domains of the receptor, thereby modulating its functionality. In the present Thesis we study the effects exerted either by alterations of cellular lipids such as cholesterol, sphingomyelin, or ceramides, on the synthesis and trafficking of the AChR, as well as on its affinity for ligands and stability in the plasma membrane. All these parameters were evaluated using, as experimental model, CHO-K1/A5 cells, a cell line developed in our laboratory that heterologously express the adult form of the AChR (α2βδε). Firstly, we evaluated the effects of chronic metabolic cholesterol depletion elicited by the drug Mevinolin, a potent inhibitor of the microsomal enzyme, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase, the limiting enzyme in cholesterol biosynthesis. We determined that when cellular cholesterol levels decrease, the number of AChRs present at the plasma membrane of CHO-K1/A5 cells undergo a drastic diminution (46%), with the concomitant increase in the number of intracellular receptors. These variations are due to an inhibition of the exocytic traffic of the protein with the consequent retention of the AChR at the level of the TGN. In addition, we observed that under control conditions the AChR is partially localized in detergent-resistant membranes (DRMs) obtained from the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, and that cholesterol depletion affects such distribution, decreasing the proportion of AChRs present in those membrane domains. Altogether, these results lead us to conclude that cholesterol modulates the transport of newly synthesized AChRs to the cell surface by association of these receptors with lipid platforms enriched in cholesterol. Secondly, we studied the effects exerted by ceramides, precursors in the synthesis of sphingolipids, on different properties of the AChR. To this end, the cells were either incubated with different concentrations of short-chain or long-chain ceramides or exposed to incubation with sphingomyelinase in order to evaluate the effects exerted by the generation of endogenous ceramides. We demonstrate the effectiveness of ceramide treatment in modulating not only AChR trafficking but also receptor affinity for ligands. With respect to receptor trafficking, we demonstrate that ceramides modulate this process in a dual manner, either augmenting or decreasing the number of AChRs present at the cell surface depending on the lipid concentration. In addition, we observed that the affinity of the AChR for the ligand αBTX increased when cells were incubated with high ceramide concentrations (25 or 37.5 μM). In contrast, low ceramide concentrations (5 μM) exerted no such changes. Finally, we determined that the generation of endogenous ceramides by treatment of cells with sphingomyelinase also effectively decreased AChR levels at the cell membrane by enhancing receptor endocytosis.

Las propiedades del receptor nicotínico colinérgico muscular (AChR) están reguladas por los lípidos de la membrana. Por tratarse de una proteína integral, desde su síntesis hasta su aparición en la sinapsis y posterior degradación, el AChR esta inmerso en una bicapa lipídica, cuya composición está pre-determinada y finamente controlada por la célula. Por lo tanto, el análisis funcional de la relación entre los lípidos y el AChR requiere de un sistema celular que funcione a modo de tubo de ensayo, para evitar los modelos artificiales puros con membranas reconstituídas. Con este propósito, generamos modelos celulares que expresan heteróloga y onstitutivamente el AChR y en los que se puede modificar parcial y selectivamente el contenido de ciertas especies lipídicas. En una primera etapa a través de la cotransfección del ADNc de las subunidades del AChR adulto de ratón en una línea celular con metabolismo lipídico normal, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c), establecimos el sistema de referencia. Posteriormente, generamos dos modelos experimentales con líneas celulares mutantes que eran deficientes en el metabolismo lipídico: una línea mutante de CHO-K1, denominada SPB-1deficiente en esfigomielina (SM) (Hanada et al., 1990) y otra línea derivada de CHO-K1, auxotrófica, llamada PSA-3, deficiente en fosfatidilserina (PS). Obtuvimos la estirpe SPB-1/SPH que expresa el AChR y modula, por efecto de la temperatura, la actividad de la enzima serina palmitoil transferasa (SPT), clave en la vía de síntesis de los esfingolípidos. A temperaturas de cultivo entre 33 C y 37 C la actividad de la enzima representa sólo del 4 al 8% de la actividad normal, lo cual disminuye los niveles celulares de SM y gangliósidos como el GM3 a valores menores del 1%. Con este modelo, determinamos que no existen diferencias en los parámetros electrofisiológicos y en las propiedades farmacológicas del receptor, y caracterizamos la participación activa de la SM en los mecanismos que regulan el tráfico exocítico de la proteína a la membrana plasmática. También generamos la línea clonal PSA/AChR, que expresa el AChR y no es capaz de realizar normalmente la síntesis de PS por tener alterada una de las enzimas que catalizan su síntesis. Por este motivo, requiere del agregado exógeno del fosfolípido para su normal crecimiento. Transfectadas las células y seleccionados los clones positivos, analizamos el ARN por RT-PCR para determinar la expresión de las subunidades. Con los clones elegidos realizamos ensayos de unión a [125I]α-bungarotoxina, un radioligando específico para AChR, determinándose los parámetros cinéticos y farmacológicos. Los parámetros electrofisiológicos del canal se caracterizaron por la técnica de patch-clamp y el análisis topológico de la expresión por microscopía de fluorescencia. De esta manera, en cada modelo celular caracterizamos las diferencias estructurales y topológicas del AChR causadas por las variaciones en el contenido lipídico. En el segundo capítulo de esta tesis analizamos el rol que poseen los aminoácidos que están ubicados, de cara a la membrana, en contacto directo con los lípidos. Con este propósito, modificamos la estructura primaria de la proteína por medio de mutaciones simples y dobles, en residuos cargados y muy conservados, situados en los extremos del segmento M4 a la altura de las cabezas polares de los fosfolípidos. Por co-transfección de una subunidad mutada con el resto de las subunidades en la versión salvaje, generamos cinco líneas clonales mutantes. En estos modelos se realizaron ensayos farmacológicos con [125I]-BTX, microscopía de fluorescencia y técnicas bioquímicas que nos permitieron determinar la magnitud de la expresión del receptor mutado y los cambios estructurales y funcionales que se produjeron cuando los diferentes residuos del AChR fueron mutados. / The properties of the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) are modulated by membrane lipids. As an integral protein, the AChR - from synthesis to appearance in synapses and further degradation- is immersed in a lipid bilayer. The composition of this bilayer is pre-established and finely controlled by the cell. Therefore, the functional analysis of the lipid-AChR relationship requires a cell system that behaves as test tube, to prevent pure artificial models with reconstituted membranes. For this purpose, the AChR was heterologoulsy and constitutively expressed in cell lines, where the lipid content can be partially and selectively modified. In a first stage, the reference system was established by means of transfection of adult mouse AChR subunits cDNAs into a cell line with normal lipid metabolism, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c). Then, two experimental models were generated with mutant cell lines which were defective in lipid metabolism: a CHO-K1 mutant line, called SPB-1, deficient in sphyngomyelin (SM) (Hanada et al., 1990) and another auxotrophic line derived from CHO-K1, called PSA-3 and phosphatydilserine deficient (PS). The SPB-1/SPH clone was obtained, which expresses the AChR and modulates, by effect of temperature, the activity of the serine palmitoyl transferase (SPT), which is key to the sphingolipids synthesis pathway. At culture temperatures between 33 C and 37 C, the enzyme activity represents only from 4% to 8% of normal activity, thus reducing cell levels of SM and gangliosides such as GM3 to values lower than 1%. With this model, we established that the electrophysiological parameters and the pharmacological properties of the receptor show no differences. However, we were able to characterize the active participation of SM in the mechanisms that regulate the exocytic protein traffic to the plasma membrane. In addition, a PSA/AChR clone line was generated, which expresses the AChR and is not capable to synthesize PS normally, because one of the enzymes that catalyzes this synthesis is altered. Thus, it requires exogenous PS for normal growth. Once the cells were transfected and the positive clones selected, we analyzed the RNA by RT-PCR to determine the expression of the subunits. With these clones, we performed binding studies with [125I]-bungarotoxin, an AChR specific radioligand, to determine kinetic and pharmacological parameters. The electrophysiological parameters of the channel were characterized by the patch-clamp technique and the topological analysis of the expression by fluorescence microscopy. In this way, on each cell line, we characterized the structural and topological AChR differences caused by lipid content variations. In a second stage of this Thesis, the role of the aminoacids which are located at the membrane facing extremes in direct contact with the lipids was analyzed. For this purpose, we modified the primary structure of the protein by means of simple and double mutations, in highly conserved and charged residues, located at the M4 segment extremes at the level of the phospholipid polar heads. By transfection of a mutated subunit together with the rest of the subunits in their wild-type version, we generated five mutant clone lines. These models were subjected to pharmacological tests with [125I]-BTX, fluorescence microscopy and biochemical techniques that allowed us to establish the expression amount of the mutated receptor and the structural and functional changes that took place when the different residues were mutated.

El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar si la droga anticonvulsiva Lamotrigina (6-(2,3-diclorofenil) 1,2,4-triazina-3, 5-diamina) interacciona con el AChR. Tal objetivo se asienta en el hecho que tanto el epifenómeno de la activación del AChR (luego de la unión con su ligando) es la permeación del Na+, al igual que el blanco farmacológico de la Lamotrigina (LTG), explotado en terapéutica. En una primera etapa, estudiamos mediante la técnica electrofisiológica de patch-clamp si la LTG interacciona de forma directa con el AChR muscular. Elegimos este subtipo de AChR por ser el mejor caracterizado y por ser el prototipo de la familia de receptores nicotínicos. Efectivamente, al exponer las células CHO-K1/A5, que expresan AChR muscular adulto (Roccamo et al., 1999) a la droga LTG (50-400 mM), pudimos comprobar que la LTG interacciona con los AChRs, ejerciendo un efecto bloqueador de canal abierto cuando es co-aplicada con el agonista natural ACh (1 mM). Dicho efecto es proporcional a la concentración de LTG aplicada. En una segunda etapa, analizamos si la LTG ejercía efectos a nivel celular, específicamente si la droga afectaba la morfología y/o la supervivencia celular. Al comparar las células CHOK1/A5 incubadas en presencia de LTG con respecto a las células control, en ausencia de la droga, comprobamos que no se afecta la morfología celular en presencia del anticonvulsivo. Mediante la técnica de MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 difeniltetrazol, que permite estudiar cambios en la viabilidad celular, observamos que la presencia de LTG protegía a las células CHO-K1/A5 de la muerte celular frente a un estimulo nocivo, como es la ausencia de suero en los medios de cultivo. En cambio, las células parentales CHO-K1, que carecen de AChR, no se benefician de tal protección. Estos resultados sugieren que la droga LTG ejerce algún otro tipo de efecto sobre los AChRs. Un simple bloqueador de canal abierto no podría ejercer este efecto en ausencia de agonista que mediara la apertura previa del canal. En el segundo Capítulo de esta Tesis, nuevamente recurrimos a técnicas electrofisiológicas para describir que en ausencia de agonista alguno, la LTG produce la activación del canal iónico. Estos resultados se complementan con estudios farmacológicos realizados por medio de la técnica de ligazón de I125 unido a la a-bungarotoxina (a-BTX), antagonista cuasi-irreversible del AChR, y estudios adicionales de microscopía de fluorescencia y fluorescencia en cubeta. El Capítulo 3 de esta Tesis tuvo como objetivo la obtención de un sistema celular de mamífero que expresase en forma estable a los a7 AChRs neuronales funcionalmente intactos en su superficie, con miras a futuros estudios farmacológicos sobre receptores del SNC. Obviamente, el requisito indispensable para tal fin es contar con expresión estable del a7 AChR. En el laboratorio se intentaron varias estrategias para intentar aumentar el nivel de expresión en membrana celular del a7 AChR (re-transfección de células en forma transiente con la subunidad a7, inducción del aumento de expresión con nicotina o con incubaciones a 25oC) (Schroeder et al., 2003) en células SHE-P1-ha7. Dichas células expresan en forma estable al AChR neuronal a7 (Peng et al., 1999), y aunque si bien unen a-BTX, su nivel de expresión en membrana es excesivamente bajo para su detección por técnicas de microscopía de fluorescencia o por técnicas electrofisiológicas de canal único. Es por ello que se recurrió a la tranfección de dichas células con la proteína Ric-3. Esta proteína, descubierta inicialmente en Caenorhabditis elegans (Williams et al., 2005), es requerida para la maduración de los AChRs en células que expresan endógenamente al AChR. Además se ha informado que la proteína Ric-3 homóloga humana aumenta la expresión de los a7 AChR en ovocitos de Xenopus laevis (Castillo et al., 2005). Efectivamente, a las 48 hs de tranfectar las células con el ADNc de la proteína Ric-3 pudimos observar por técnicas citoquímicas la expresión del a7 AChR en la superficie de las células SHE-P1-ha7. Dado el caracter transiente de dicha expresión, se obtuvo subsecuentemente una línea celular que expresa al a7 AChR neuronal en forma permanente, obteniéndose un clon denominado SHE-P1-ha7-Ric3. Con esta nueva herramienta celular realizamos estudios farmacológicos y electrofisiológicos para caracterizarla. En el futuro se piensa estudiar posibles interacciones de LTG con el a7AChR en esta línea celular. / In this Thesis, we investigated if the anticonvulsive drug Lamotrigine (6-(2,3-dichlorophenyl) 1,2,4-triazine-3,5-diamine) interacted with the nicotinic acetylcholine receptor (AChR). Since the most common pharmacological target of Lamotrigine (LTG) is the voltage-gated Na+channel, we investigated if this drug interacted with the AChR, based on the premise that the epiphenomenon of AChR activation is the permeation of sodium ions, as is that of LTG, exploited in therapeutic intervention. We begun by studying whether exposure to LTG (1-400 mM) modified kinetic parameters of the AChR. We chose to perform our experiments on the muscle AChR subtype because it is the best characterized prototype channel of the Ligand-gated ion channel (LGIC) superfamily. Indeed, when CHO-K1/A5 cells heterologously expresssing adult muscle-type AChR (Roccamo et al., 1999) were exposed to LTG (50-400 mM) and studied with the electrophysiological patch-clamp technique, we demonstrated that LTG interacted with AChRs and exerted a channel blocking effect when co-applied with ACh (1mM) in a concentration-dependent manner. In a subsequent series of experiments, we studied whether LTG caused any effect at the cellular level, more specifically, on cell morphology and/or cell survival. LTG produced no alterations of morphological parameters with respect to cells incubated in the absence of LTG. We subsequently resorted to the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay to assess whether LTG affected cell survival upon submission of cells to a serum deprivation stress. CHO-K1/A5 cells were protected from cell death only after being incubated with LTG. This protection did not occur in CHO-K1 cells, devoid of AChRs. These results lead us to conclude that the anticonvulsive drug LTG displays other forms of interaction with the AChR. A simple channel blocker would not exert such an effect in the absence of a previous agonist-mediated channel opening. The second Chapter of this Thesis also employs electrophysiological techniques to describe the direct activation of the AChR channel by LTG in the absence of an agonist. Such an effect is further supported by a combination of pharmacological radioligand binding studies using [125I]-a-bungarotoxin (a-BTX[125I]), fluorescence spectroscopy, and fluorescence microscopy. The third Chapter of this Thesis focuses on the study of the a7 neuronal type of AChR. Our main objective was the obtention of a mammalian cell line expressing in a functional manner a7 AChRs at the cell membrane. Several techniques were attempted in the laboratory (retranfection of the a7 subunit, incubation of the cells for 48 h in the presence of nicotine, incubation of the cells at 25oC) in order to enhance the number of a7 AChR at the cell surface of SHE-P1-ha7 (Peng et al., 1999). Althought SHE-P1-ha7 cells express the a7 AChR in a stable manner, the level of expression is so low at the cell surface that it can not be detected by fluorescence microscopy or electrophysiological techniques at the singlechannel level. For this reason we decided to transfect the SHE-P1-ha7 cells with the Ric-3 protein. Previous reports argued in favor of the Ric-3 protein as a necessary factor to produce levels of a7 AChR detectable at the cell surface. Ric-3 protein was first discovered in Caenorhabditis elegans and is present in cells that endogenously express a7 AChR (Williams et al., 2005). Ric-3 has proved to increase a7 AChRs in oocytes from Xenopus laevis (Castillo et al., 2005). As expected, 48 h after transfection with the cDNA coding for the Ric-3 protein, a7 AChR expression at the cell membrane increased. Upon selection of positive clones a cell line was obtained that expressed both a7 AChR and the Ric-3 protein in a stable manner; the new cell line was coined SHE-P1-ha7-Ric-3. With this new cellular tool we undertook the characterization of the functional properties of a7 AChR expressed in the mammalian cell line SHE-P1-ha7-Ric3, performing pharmacological and electrophysiological studies. In the near future we plan to study possible interactions between LTG and the neuronal a7 AChR in the SHE-P1-ha7-Ric-3 cell line.