En la presente Tesis estudiamos diferentes aspectos de la interacción entre el receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) y lípidos de la membrana, especialmente los esfingolípidos (SL) y el colesterol. En la primera sección estudiamos la participación de los SL sobre el tráfico hacia la membrana plasmática del AChR en un sistema de células no polarizadas de mamífero (células CHO-K1/A5). Demostramos que la inhibición de la biosíntesis de SL altera el transporte normal del AChR hacia la membrana plasmática y promueve su acumulación en el interior celular. Además, demostramos que los SL intervienen en estadios tempranos de la vía exocítica de esta proteína y que su déficit causa la retención y acumulación de receptores desensamblados en el retículo endoplasmático. Postulamos que los SLs tendrían una actividad similar a chaperonas proteicas, en calidad de chaperonas lipídicas, en el ensamblaje y tráfico del AChR. En el segundo capítulo estudiados la distribución y movilidad del AChR en la membrana plasmática de células CHO-K1/A5 y su relación con el colesterol. Determinamos que el AChR se encuentra distribuido en forma de pequeñas agrupaciones, en el orden de los 50 nm de diámetro, por lo cual denominamos a estas agrupaciones nano-agregados de AChR. La difusión del AChR en el plano de la membrana plasmática de las células CHO-K1/A5, comparable a la fracción móvil de AChRs de miotubos de rata, es dependiente del contenido de colesterol en la misma. La fracción de AChR móviles se reduce a la mitad cuando se elimina el colesterol de la membrana. Tanto interacciones directas del AChR con el colesterol, así como interacciones con el esqueleto cortinal de actina, participan en estos fenómenos. Los hallazgos presentados en esta Tesis contribuyen al conocimiento general de la modulación que ejercen los lípidos de las membranas biológicas sobre la biología celular del AChR. / In the present Thesis different aspects of the nicotinic acetylcholine receptor (AChR) and membrane lipids interactions were studied, especially sphingolipids (SL) and cholesterol. In the first section, the participation of SL on AChR trafficking to plasma membrane in a non-polarized mammalian cell system (CHO-K1/A5 cells) was analyzed. We demonstrate that the inhibition of SL biosynthesis impairs the normal transport of AChR to the plasma membrane and promotes its accumulation inside the cell. We further show that SLs intervene at an early stage of the exocytic pathway and that their depletion provokes the retention and accumulation of unassembled receptor in the endoplasmic reticulum. On the basis of these results we hypothesize that SLs display a chaperone-like activity, as lipid chaperones, in the assembly and trafficking of AChRs. In the second chapter, we studied the distribution and mobility of plasma membrane AChR in CHO-K1/A5 cells, and its relationship with cholesterol. We observed that the AChR is distributed in the form of small aggregates, having a diameter of 50 nm, whereby this clusters were called nano-aggregates of AChR. The diffusion of AChR in the plasma membrane plane of CHO-K1/A5 cells, comparable to AChR mobile fraction from rat myotubes, is dependent on cholesterol levels. The AChR mobile fraction was reduced to 50% when cholesterol was depleted from the plasma membrane. Direct interactions between AChR and cholesterol, as well interactions with the cortical actin skeleton, are involved in these phenomena. The results presented in this work contribute to general knowledge of lipid modulation on AChR cellular biology.

Orientador: Maria Julia Marques / Tese(mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T04:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Minatel_Elaine_M.pdf: 3919056 bytes, checksum: d240bd20bc93021c33a6a6666a17948c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi investigar se fibras musculares regeneradas de camundongos normais apresentam alteração no padrão de distribuição dos receptores de acetilcolina (AChRs) e na expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e comparar os resultados obtidos com fibras regeneradas de camundongos mdx. Para tanto, a degeneração/regeneração foi induzida através de injeções de cloridrato de lidocaína no músculo esternomastóideo (STN) esquerdo de camundongos normais. O lado contralateral foi utilizado como controle. Após 21 dias os músculos foram retirados e marcados com rodamina-a-bungarotoxina para observação dos AChRs, com o anticorpo primário monoclonal anti-nNOS para observação da expressão da nNOS e montados para tluorêscencia. Foi adicionado ao meio de montagem o marcador de DNA nuclear DAPI o que possibilitou a observação dos núcleos celulares. Através da microscopia confocal de tluorêscencia observamos que a distribuição dos AChRs nas fibras regeneradas estava alterada em relação ao padrão das fibras do músculo controle. As fibras musculares regeneradas normais exibiram o mesmo padrão de distribuição dos AChRs observado em fibras regeneradas distróficas, ou seja, os braços juncionais estavam fragmentados, originando ilhas de receptores. Nossos resultados sugerem que a alteração no padrão de distribuição dos AChRs, que é observada no camundongo mdx, pode ser conseqüência apenas da degeneração/regeneração da fibra muscular e não devido a deficiência de distrofina. Quanto a nNOS, não houve alteração de sua expressão em fibras musculares regeneradas quando comparada com fibras do músculo controle. Isto sugere que a diminuição de sua expressão observada nos camundongos mdx pode ser atribuída a ausência de distrofina / Abstract: The aim of the present investigation was to study whether normal regenerated muscle fibers show changes in the pattem of distribution of the acetylcholine receptors (AChRs) and in neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression. Degenerative-regenerative changes were experimentaly induced in normal muscle fibers of mouse left sternomastoid (STN) muscle by injecting lidocaine hydrochIoride. The contralateral side .served as a controI. 21 days after lidocaine injection, the STNs (right and left) were removed, labelled with rhodamin a-bungarotoxin for AChRs observation, with anti-nNOS for nNOS observation and mounted in special mouting media for fluorescence with DAPI, a DNA stain for nuclei. By using fluorescence confocal microscopy regenerated muscle fibers showed disrupted AChRs distribution when compared to controls. Normal regenerated fibers exhibited the same pattem of AChR distribution as seen in dystrophic regenerated fibers. Our results suggest that changes in AChRs distribution seen in mdx were probably a consequence of muscle fiber degeneration-regeneration, rather than a symptom of dystrophin deficiency. Conversely, there were no changes in nNOS expression in normal regenerated fibers when compared to normal fibers, suggesting that the decrease in nNOS expression reported for mdx mice might be attributed to the absence of dystrophin / Mestrado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Paulo Afonso Ribeiro Jorge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T03:43:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abdalla_LuizAntonio_D.pdf: 2307455 bytes, checksum: 2ecdebde34e296b4638bc3a971c60f8b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Foram estudados os efeitos da vitamina E sobre o fluxo coronário endotélio-dependente em cães hipercolesterolêmicos. A pesquisa foi realizada em 21 cães machos adultos, pesando em média 7,4±1,0 kg, que foram divididos em três grupos: controle, hipercolesterolêmico e vitamina E. Os animais do grupo hipercolesterolêmico foram alimentados com uma dieta rica em colesterol (5% g/g) e óleo de coco (10% g/g) por 40 dias. O grupo vitamina E recebeu a mesma dieta, acrescida de 400 Ui de vitamina E, durante os últimos 15 dias do experimento. Os níveis de colesterol total sérico foram avaliados no começo e no final do estudo, por meio de "kits" enzimáticos e espectrofotômetro Beckman 700. O fluxo coronário foi medido por um fluxômetro eletromagnético (Caroline Instruments, Inc.), usando-se um probe, posicionado na artéria coronária descendente anterior esquerda, próximo ao óstio. Uma agulha, conectada a uma bomba de infusão, foi introduzida na artéria coronária para administração de acetilcolina (ACH) e nitroprussiato de sódio (NPS), à velocidade de 5 mg/kg/min. A aorta foi canulada para medida da pressão arterial por intermédio de transdutor acoplado a polígrafo da marca Siemmens (Mingograph 804). Os teores de colesterol e malonodialdeído (MOA) foram, também, medidos em segmentos de vaso coronário.Após 40 dias, os níveis de colesterol sérico haviam aumentado em 203%, no grupo hipercolesterolêmico e, em 198%, no grupo da vitamina E. Entretanto, esta diferença não foi significante (P>0,05). A pressão sangüínea na aorta e a freqüência cardíaca permaneceram sem alteração, durante a administração de ACH. Contudo, a pressão sistólica e a diastólica diminuíram e a freqüência cardíaca aumentou durante a infusão de NPS.O teor de colesterol tecidual e MOA aumentaram, significativamente, (P<0,05) nas amostras de artéria coronária do grupo hipercolesterolêmico, comparativamente aos animais do grupo-controle. A vitamina E reduziu o colesterol tecidual e o MDA nos animais hipercolesterolêmicos (P<0,05).A elevação do percentual do fluxo coronário, durante a administração da ACH, foi significativamente menor no grupo hipercolesterolêmico, quando comparada com an1ma1_ do grupo-controle (P<O,O5), mas manteve-se inalterada no grupo da vitamina E (p>0,05). O fluxo coronário aumentou, durante a administração de NPS, no grupo da vitamina E (P<0,05).Concluiu-se que a hipercolesterolemia reduziu o fluxo coronário endotéliodependente e aumentou o teor de colesterol tecidual e de MDA nas artérias coronárias. A vitamina E reduziu o MDA e o teor de colesterol tecidual, sem afetar significativamente o solúvel de colesterol sérico. A vitamina E restaurou o fluxo coronário, revertendo a disfunção endotelial na hipercolesterolemia / Abstract: The effects of vitamin E on endothelium-dependent coronary flow were studied in hypercholesterolernic dogs. Adult mongrel dogs weighing 7.4±1.0 kg were divided into control, hypercholesterolernic and vitamin E groups. The animals in the hypercholesterolernic group were fed a diet enriched with cholesterol (5%w/w) and coconut oil (l0%w/w) for 40 days. The vitamin E group received the same diet plus 400 IU of vitamin E during the last 15 days of the experiment. Total serum cholesterol levels were evaluated at the beginning and at the end of the experiment using a commercial enzyme kit and a Beckman analyzer. The coronary flow was determined byelectromagnetic flowmetry using a probe positioned in the left anterior descending coronary artery, near the ostium. A needle connected to a perfusion pump was introduced into the coronary artery for the administration of acetycholine and sodium nitroprusside at a rate of 5 ug!kg per min. The aorta was cannulated for the measurement of arterial blood pressure via a pressure transducer coupled to a Siemens multi-channel recorder. The tissue cholesterol content and malonic dialdehyde (MDA) were also measured in isolated coronary vessel specimens. At the end of 40 days, the serum cholesterol levels had increased by 203% and 198% in the hypercholesterolernic and vitamin E groups, respectively. However, the difference in the levels of these two groups was not significant (P>0.05). The aortic blood pressure and heart rate remained inchanged during acetylcholine administration. In contrast, systolic and diastolic pressure fell and the heart rate increased during the infusion of sodium nitroprusside. The tissue cholesterol content and MDA were significantly (P<0.05) increased in coronary artery specimens from the hypercholesterolernic compared to control animals. Vitamin E was able to reduce these increases in cholesterol treated animals (P<0.O5). The percent change in coronary flow during acetylcholine administration was significantly lower in the hypercholesterolernic group when compared with control animals (P<0.05) but was unaltered in the vitamin E group (P>0.05). During sodium nitroprusside administration, the coronary flow increased in the vitamin E group (P<O.O5). The authors conclude that hypercholesterolernia reduces endothelium-dependent coronary flow and increases the tissue cholesterol content and MDA of coronary arteries. Vitamin E decreases the MDA and the tissue cholesterol content without significantly affecting the total serum cholesterol level. Vitamin E may thus restore flow by reverting endothelial dysfunction / Doutorado / Medicina Interna / Doutor em Ciências Médicas

El Síndrome de Down (SD) se determina por la trisomía del autosoma 21 humano, y sus alteraciones se asocian a sobreexpresión o bien desregulación de los productos génicos derivados de este cromosoma. La trisomía 16 (Ts16) murina es un modelo animal de este síndrome, debido a la gran homología entre los cromosomas humano y murino correspondiente. Desafortunadamente, la condición en el modelo murino no es viable. Frente a esto se han generado líneas celulares inmortalizadas derivadas de corteza de ratón normal y trisómico 16, denominadas CNh y CTb respectivamente. Estas líneas celulares sobreexpresan genes relacionados con el SD y muestran función colinérgica alterada (menor incorporación de colina de alta afinidad (IC), expresión de la acetilcolintransferasa (ChAT) y liberación fraccional de acetilcolina (LF) frente a una estimulación), similares a las previamente encontradas en cultivos primarios de corteza Ts16. También se han encontrado elevados niveles de Mioinositol en pacientes con SD, lo cual estar relacionado con la sobreexpresión del Transportador Na+ /Mioinositol SMIT1, cuyo gen se encuentra ubicado en cromosoma 16 murino. Con el objeto de dilucidar la participación de SMIT1 en la disfunción colinérgica descrita anteriormente, decidimos reducir la expresión de SMIT1 transfectando las células con secuencias de antisentido específicos para mRNA en nuestras líneas celulares derivadas de corteza cerebral de Ts16 (CTb) comparadas con la línea derivada de un animal normal (CNh). Posterior a la transfección, estudios de Western Blot (WB) mostraron una reducción en la expresión de SMIT1 en 10%, 40%, y 42% a 24, 48 y 10 72 horas respectivamente, comparadas con niveles de SMIT1 en cultivos de la líneas celulares trisómicas CTb sin transfectar (n=6 p<0,01). Una vez normalizada la expresión de SMIT1, estudiamos la IC en CTb y CNh, encontrando que la línea CTb exhibe una reducción en la IC de un 80%, 85% y a 2 y 5 minutos de incubación con 1µCi de [3 H]- colina respectivamente, comparada con CNh. A 72 horas post-transfección los niveles en la IC fueron esencialmente similares en ambos tipos celulares. Finalmente, la LF, la cual está reducida en CTb comparada con CNh después de una despolarización generada por glutamato, nicotina , muscarina y KCl, , muestra un progresivo incremento después del Knockdown del SMIT al ser estimulada con nicotina y muscarina, mostrando valores similares a CNh después de 48 horas post-transfección. Sin embargo, al inducir despolarización con KCl y estimular con Glutamato extracelular, las líneas CTB tranfectadas no exhibieron diferencias con respecto a la línea celular trisómica CTb sin transfectar. Los resultados sugieren que la normalización en la expresión de SMIT1 en la línea CTb mediante la transfección con oligonucleótidos antisentido revierten: 1) la reducción de la incorporación de 3H colina, y 2) el déficit en la liberación de acetilcolina frente a agonistas Colinérgicos (Nicotina y Muscarina). Los resultados pueden constituir un punto de partida para el diseño de una terapia farmacológica que apunte a recuperar las funciones cognitivas, en particular las relacionados con sistemas colinérgicos, en pacientes con SD.

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CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / No presente trabalho, foi avaliado a interaÃÃo entre os sistemas dopaminÃrgico e colinÃrgico atravÃs do estudo dos efeitos comportamentais (campo aberto e catalepsia) e neuroquÃmicos (densidade de receptores dopaminÃrgicos (D1 e D2-sÃmile) e muscarÃnicos (M1+M2-sÃmile) em corpo estriado de rato. As seguintes drogas foram utilizadas: mazindol (agonista dopaminÃrgico indireto), apomorfina (agonista dopaminÃrgico D1-sÃmile e D2-sÃmile), pimozida (antagonista dopaminÃrgico D2-sÃmile), SCH 23390 (antagonista dopaminÃrgico D1-sÃmile), pilocarpina (agonista muscarÃnico M1-sÃmile), carbacol (agonista muscarÃnico M2-sÃmile), pirenzepina (antagonista muscarÃnico M1-sÃmile), atropina (antagonista muscarÃnico M1 e M2 nÃo seletivo), clozapina (neurolÃptico atÃpico). Os resultados mostraram que a pimozida e o carbacol, sozinhos ou associados, causaram um aumento da resposta catalÃptica e uma diminuiÃÃo da atividade locomotora. O mazindol tambÃm aumentou a atividade locomotora. Carbacol, nas menores doses, e o mazindol aumentaram a densidade de receptores D1-sÃmile. A pimozida e a atropina, isoladamente, aumentaram a densidade de receptores D1-sÃmile no corpo estriado enquanto que a atropina causou uma diminuiÃÃo dos receptores D2-sÃmile e uma upregulation dos receptores muscarÃnicos. O mazindol aumentou o binding de 3H-NMS no corpo estriado. O presente trabalho sugere, de maneira geral, que existe uma relaÃÃo entre os receptores muscarÃnicos M1 e M2 com os receptores dopaminÃrgicos D1 e D2, sendo que esta relaÃÃo pode ocorrer de maneira positiva ou negativa, dependendo da seletividade e da dose das drogas utilizadas / In the study, the interaction between the dopaminergic and cholinergic systems through the study of behavioral (open field and catalepsy) and neurochemical (density of dopaminergic receptor (D1 and D2-like) and muscarinic (M1+M2-like)) effect in striatum rat was evaluated. The following drugs were used: mazindol (indirect dopaminergic agonist), apomorphine (D1-like and D2-like dopaminergic agonist), pilocarpine (M1-like muscarnic aginist), carbachol (M-2like agonist muscarinc), pirenzepine (M1-like antagonist muscarinic), atropine (non-selective M1 and M2 antagonist muscarinic), clozapina(non-typical neuroleptic). The results showed that the pimozida and carbachol, alone or associated, caused increase in the cataleptic response and reduction in the motor activity. The mazindol also increased the motor activity. In small dosage, the carbachol and mazindol increased the density of D1-like receptors. Isolated, the pimozida and atropine increased the density of the D1-like receptors in striatum whereas the atropine caused a reduction of D2-like receptors and upregulation of muscarinic receptors. This work suggests a relationship, between muscarinc receptors M1 and M2 and dopaminergic receptors D1 and D2, and that this relationship can occur in a positive and negative manner, depending on the selectivity and the dose of the used drug

En esta Tesis doctoral se profundizó en el estudio de la interacción lípidoreceptor de acetilcolina nicotínico (AChR) en dos aspectos: por un lado, el mecanismo de inhibición de ácidos grasos libres (AGLs), antagonistas no competitivos del AChR, y por el otro, la ubicación del AChR en dominios líquidoordenados (Lo) condicionada por dos características particulares de la membrana. Con la finalidad de dilucidar el mecanismo de antagonismo de los AGLs sobre el AChR, se utilizaron AGLs con un doble enlace único en diferentes posiciones de una cadena acílica de 18 átomos de carbono. Estudios funcionales realizados con la técnica de patch-clamp han mostrado que solo el cis-6-18:1 y el cis-9-18:1 reducen la duración del estado de canal abierto del receptor, sugiriendo, por lo tanto, un mecanismo de bloqueo alostérico del canal. Mediante espectroscopía de fluorescencia se comprobó que todos los AGLs se ubican en la interfase lípido-AChR, quedando el cis-6-18:1 restringido a los sitios denominados sitios anulares, mientras que el resto de los AGLs ocupa también sitios no-anulares. Por otro lado, estudios de polarización de fluorescencia mostraron que el AGLs cis-9-18:1 es el que ocasiona el mayor desorden en la membrana. Se comprobó i) que todos los cis-AGLs generan cambios conformacionales del AChR a nivel transmembrana, ii) que los cis-9-18:1, cis-11- 18:1 y cis-13-18:1 perturban al AChR en su estado de reposo e iii) que los cis-6-18:1 y cis-9-18:1 son los que causan una mayor perturbación del estado desensibilizado. De esta manera, la posición e isomería del ángulo de torsión de los AGLs insaturados serían un factor clave en el bloqueo del AChR, sugiriendo entonces que los AGLs con un único doble enlace y ubicados superficialmente en la membrana inhiben en forma directa la función del AChR, posiblemente al perturbar una secuencia aminoacídica transmembrana involucrada en los cambios alostéricos necesarios para la apertura del canal iónico. Se postula que en la membrana plasmática el AChR se encuentra en dominios lipídicos denominados “balsas” (“rafts”). Sin embargo, el AChR no muestra preferencia por dominios Lo en sistemas modelo compuestos por esfingomielina (SM), colesterol (Col) y POPC (1:1:1), pero sí lo hace un segmento transmembrana (γM4) que exhibe mayor contacto con los lípidos. Es decir, su distribución no dependería exclusivamente de sus propiedades intrínsecas sino también de señales extrínsecas a la proteína. En este trabajo de Tesis se estudió la posible partición diferencial del AChR en los dominios Lo en dos sistemas modelo diferentes en función de: a) la presencia de diferentes especies puras de SM en la membrana, y b) la existencia de asimetría transbicapa en el sistema modelo, mediante el agregado de SM de cerebro (bSM) en la hemicapa externa. Tanto la existencia de asimetría como la presencia de 16:0-SM o 18:0-SM, en comparación con las bSM y 24:1-SM, producen una partición preferencial del AChR en los dominios Lo. De este modo, la localización del AChR en estos dominios depende no solo de sus propiedades sino también de las características propias de la membrana en la que se encuentra. Entender la interacción lípido-AChR es de gran importancia para determinar tratamientos que puedan mejorar o inhibir la función del AChR y tratar enfermedades que lo involucren. / In this Ph. D. thesis the understanding of the lipid-niconitic acetylcholine receptor (AChR) interaction was furthered in two aspects, namely the inhibition mechanism of free fatty acids (FFA), non-competitive AChR antagonists, and AChR location in liquid-ordered (Lo) domains conditioned by two membrane characteristics. To elucidate FFA’s antagonism mechanism, FFA with only one double bond in different positions of an 18-carbon acyl chain were tested on AChR. Patch-clamp functional studies showed that only cis-6-18:1 and cis-9-18:1 reduce the duration of the AChR open state, thus suggesting an allosteric blocking mechanism. Fluorescence spectroscopy measurements demonstrated that all FFA locate in the AChR-lipid interfase, with cis-6-18:1 restricted to anular sites, while the rest of the FFA tested also ocupy non-anular sites. Fluorescence polarization studies showed that cis-9-18:1 causes the highest membrane disorder of all FFA tested. It was determined that i) all cis-FFA generate AChR conformational changes at a transmembrane level, ii) only cis-9-18:1, cis-11-18:1 and cis-13-18:1 disturb AChR resting state and iii) cis-6-18:1 and cis-9-18:1 are the ones that cause the highest disturbance of the desensitized state. Thus, the position and isomerism of the torsion angle of unsaturated FFAs are probably a key factor in terms of AChR blockage, possibly by perturbing a transmembrane aminoacidic sequence involved in the allosteric changes necessary for ion channel gating. In the plasma membrane, AChR is postulated to be located in lipid domains known as rafts. However, AChR shows no preference for Lo domains in model systems – composed of sphingomyelin (SM), cholesterol (Chol) and POPC (1:1:1) –, but a transmembrane segment (γM4) that in closest contact with lipids does have preference for them. This means that AChR distribution seems not to exclusively depend on its intrinsic properties but on signals external to the protein. In this Ph. D. thesis a posible differential AChR partitioning in Lo domains was studied in two model systems as a function of a) the presence of different pure SM species in the membrane and b) the existence of transbilayer asymmetry in the model system, by the addition of brain SM (bSM) in the external hemilayer. Both asymmetry and the presence of either 16:0-SM or 18:0-SM, in comparison with bSM or 24:1-SM, lead to an AChR preferential partitioning in Lo domains. AChR location in these domains depends not only on its properties but also on the characteristics of the membrane in which the ion channel is immersed. Understanding lipid-AChR interaction is of great importance to determine treatments that can either improve or inhibit AChR function and, this, in turn, will help determining the treatment of diseases in which AChR is involved.

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