DGICYT (PB95-0690 y PB92-0346); Science Plan de la Comunidad Económica Europea (SC1*CT91-0666)

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:45:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Inae Braga (inae_braga@yahoo.com.br) on 2018-05-04T20:01:34Z No. of bitstreams: 1 TESE INAÊ 2018 versão final Pós Defesa1.pdf: 6269053 bytes, checksum: 6263bd7a8bfc567a741ee29acc62e4a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Santulo Custódio de Medeiros null (asantulo@rc.unesp.br) on 2018-05-07T12:34:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 braga_i_dr_rcla.pdf: 4231965 bytes, checksum: 91f9a4741e13f51a9d7686b64f56a083 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T12:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 braga_i_dr_rcla.pdf: 4231965 bytes, checksum: 91f9a4741e13f51a9d7686b64f56a083 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A soja (Glycine max (L.) Merrill), uma das principais culturas oleaginosas, é muito sensível a fatores ambientais, sendo a deficiência hídrica um fator particularmente limitante para seu desenvolvimento e produção. Algumas substâncias podem ser utilizadas para minimizar os efeitos danosos do estresse hídrico. Bioreguladores, tais como ácido γ-aminobutírico (GABA) e Acetilcolina (Ach) atuam na defesa de plantas em respostas ao estresse, desempenhando um papel osmoprotetor e na regulação do movimento estomático, respectivamente. O objetivo deste estudo foi de analisar diferentes modos de aplicação exógena desses dois bioreguladores (isoladamente ou em combinação) e estudar o seu efeito na regulação dos processos de resposta de soja ao deficit hídrico. Para tanto, foi realizada a aplicação combinada dos dois bioreguladores na dose de 2,0 mM em plantas de soja cv. Intacta sob diferentes regimes hídricos. Os fatores estudados foram: 1) da aplicação dos bioreguladores (i) nas sementes- S (ii) via foliar F; (iii) nas semente e via foliar - SF; (iv) controle sem aplicação - C; e 2) regimes hídricos: (i) 100% da capacidade de campo (CC) e (ii) suspensão da irrigação (SI). Foram realizadas análises de trocas gasosas foliares e biomassa para caracterização fisiológica das plantas, das atividades das enzimas anti-oxidantes (CAT e APX) e das alterações nas respostas transcricionais dos genes induzidos por deficiência hídrica, P5CS, LEA e ABA2. Para os tratamentos de déficit hídrico, foi observada uma queda de 93% da capacidade fotossíntécia (PN) no sexto dia após a suspensão da irrigação, assim como diminuição da biomassa, além de apresentar maior expressão dos genes induzidos por deficiência hídrica. O tratamento da combinação das substâncias GABA e Ach aplicados na semente e na folha sob déficit hídrico, destacou-se por apresentar menor queda da fotossíntese, assim como, aumento para condutância estomática e biomassa. Para as análises transcricionais a aplicação dacombinação de GABA e Ach em semente e folha apresentaram menor expressão dos genes P5CS, LEA e ABA2 e maior atividade das enzimas SOD, CAT e APX, em relação ao tratamento controle Em nosso estudo foi possível observar que a aplicação combinada das substâncias GABA e Ach na semente e folha a 2,0 mM promoveu uma melhora do desempenho das plantas por meio da açãode Ach promovendo um aumento sobre a condutância estomática e um efeito osmoprotetor de GABA sobre as plantas em situação de estresse. / Soybean (Glycine max (L.) Merrill), a major oil crop, is very sensitive to environmental factors, and water deficiency is a particularly limiting factor for its development and production. Some substances can be used to minimize the harmful effects of water stress. Bioregulators, such as γ-aminobutyric acid (GABA) and Acetylcholine (Ach) act in the defense of plants in response to stress, playing an osmoprotective role and regulating stomatal movement, respectively. The objective of this study was to analyze different modes of exogenous application of these two bioregularators (alone or in combination) and to study their effect on the regulation of soybean response processes to the water deficit. Therefore, it was used in combination of two bioregulator dose of 2.0 mM in soybean plants cv. Intact under different water regimes. The factors studied were: 1) the application of bioregulators (i) in seeds- S (ii) in leaf L ; (iii) in the seed and leaf - SL; (iv) control without application - C; and 2) water regimes: (i) 100% of field capacity (CC) and (ii) suspension of irrigation (SI). Leaf gas exchange and biomass analyzes were performed for the physiological characterization of plants, the activities of the antioxidant enzymes (CAT and APX) and the changes in the transcriptional responses of genes induced by water deficiency, P5CS, LEA and ABA2. For water deficit treatments, a 93% decrease in the photosynthetic capacity (PN) was observed on the sixth day after the suspension of irrigation, as well as a decrease in biomass, in addition to a greater expression of genes induced by water deficiency. The treatment of the combination of the GABA and Ach substances applied to the seed and the leaf under water deficit was highlighted by lower photosynthesis decrease, as well as an increase in stomatal conductance and biomass. For the transcriptional analysis the application of GABA and Ach in seed and leaf showed lower expression of the genes P5CS, LEA and ABA2 and greater activity of the SOD, CAT and APX enzymes, in relation to the control treatment. In our study it was possible to observe that the combined application of the GABA and Ach substances in the seed and leaf at 2.0 mM promoted an improvement of the performance of the plants through the action of Ach promoting an increase on the stomatal conductance and an osmoprotective effect of GABA on plants in a situation of stress.

Orientador: Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T17:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taniguti_AnaPaulaTiemi_M.pdf: 2340108 bytes, checksum: d096d9870bc1650ef2e8526da0771778 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia hereditária caracterizada pela falta de distrofina. Camundongos da linhagem mdx, tal como pacientes com DMD, não expressam a distrofina, desenvolvendo distrofia muscular semelhante a DMD. A junção neuromuscular distrófica apresenta alteração no padrão de distribuição dos receptores de acetilcolina (AChRs), provavelmente devida à falta de distrofina. Alterações semelhantes na distribuição dos receptores ocorrem em fibras musculares normais regeneradas e o terminal nervoso tem papel determinante nestas alterações. O presente trabalho teve por objetivo verificar se o terminal nervoso influencia o padrão de distribuição dos AChRs nas fibras musculares regeneradas distróficas. Animais mdx com 01 mês e 06 meses de idade tiveram o músculo esternomastóideo esquerdo desnervado e injetado com cloridrato de lidocaína. O músculo contra- lateral serviu como controle. Após 10 dias, os animais foram sacrificados, os AChRs marcados com rodamina-a-bungarotoxina e observados ao microscópio confocal. Músculos inervados de animais mdx com 01 mês de idade apresentaram os AChRs distribuídos em ilhas em 75,2% das JNMs observadas (n=137), enquanto animais com 06 meses de idade apresentaram 100% das JNMs (n=114) em ilhas. Na ausência da inervação, os AChRs distribuíram-se em padrão desnervado tipo braços contínuos em 79,4% das JNMs observadas (n=90) de animais com 01 mês de idade e em padrão desnervado tipo ilhas em 100% das JNMs (n=100) de animais com 06 meses de idade. Estes resultados sugerem que o terminal nervoso contribui de forma significativa para as alterações no padrão de distribuição dos AChRs de músculos distróficos inervados / Abstract: Changes in the distribution of acetylcholine receptors have been reported to occur at the neuromuscular junction of mdx mice and may be a consequence of muscle fiber regeneration rather than the absence of dystrophin. In the present study, we examined whether the nerve terminal determines the fate of acetylcholine receptor distribution in the dystrophic muscle fibers of mdx mice. The left sternomastoid muscle of young (1 month old) and adult (6 months old) mdx mice was injected with 60 ml lidocaine hydrochloride to induce muscle degeneration-regeneration. Some mice had their sternomastoid muscle denervated at the time of lidocaine injection. After 10 days of muscle denervation, nerve terminals and acetylcholine receptors were labeled with 4-Di-2-ASP and rhodamine-a-bungarotoxin, respectively, for confocal microscopy. In young mdx mice, 75% (n=137 endplates) of the receptors were distributed in islands. The same was observed in 100% (n=114 endplates) of the adult junctions. In denervated-regenerated fibers of young mice, the receptors were distributed as branch- like aggregates in 80% of the endplates (n=90). In denervated-regene rated fibers of adult mice, the receptors were distributed in island-like aggregates in 100% of the endplates (n=100). These findings suggest that nerve-dependent mechanisms are involved in the changes in receptor distribution in young dystrophic muscles. In older dystrophic muscles other factors may play a role in their distribution / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-28T14:50:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DE PLANTAS DA CAATINGA COM INDICAÇÃO POPULAR PARA DISTÚRBIOS DO SIS.pdf: 10498637 bytes, checksum: 6697d682e5713ad3939431b53b38ec0b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-28T14:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DE PLANTAS DA CAATINGA COM INDICAÇÃO POPULAR PARA DISTÚRBIOS DO SIS.pdf: 10498637 bytes, checksum: 6697d682e5713ad3939431b53b38ec0b (MD5) Previous issue date: 2016-03-18 / FACEPE / No Brasil e no mundo há um crescimento na população de idosos e conforme as pesquisas demográficas recentes, esse aumento se explica como consequência de uma redução da fertilidade e mortalidade observada ao longo do século XX. A idade pode ser considerada como um dos fatores de risco melhor aceito para o desenvolvimento de diversas doenças, destacando-se entre elas a Doença de Alzheimer (DA). No entanto até hoje, não existe uma causa única que pode levar ao desenvolvimento da DA, mas sim um conjunto de fatores, a exemplo do estresse, danos físicos (traumas ou pancadas), déficit no metabolismo e vascularização cerebral, que associados a hipótese colinérgica, poderiam explicar melhor o surgimento desta doença. Atualmente, a terapêutica disponível para a DA baseia-se principalmente nesta hipótese, não sendo possível a cura, mas apenas o retardo da evolução da doença bem como o alívio nos sintomas que a mesma apresenta, que de certa forma contribui com a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, estão em fase não clínica de testes alguns candidatos que poderiam atuar sobre a formação das placas amilóides e diminuição dos agregados protéicos insolúveis, o que poderia evitar a evolução da doença para etapas mais severas. Na perspectiva de busca de novos fármacos, os produtos naturais apresentam relevância e as endemias de algumas espécies vegetais as deixam com composição química características daquele local específico. A Caatinga, por exemplo, é um bioma dominado por um dos tipos de vegetação cuja distribuição é totalmente restrita ao Brasil. Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo buscar novas substâncias com potencial atividade anticolinesterásica e que possam servir como alternativa para o tratamento da DA, levando em consideração a hipótese colinérgica como uma das principais causas da doença. Partindo de uma pesquisa etnofarmacológica com indicação de plantas medicinais utilizadas para patologias que pudessem ter relação ao sistema nervoso, foram coletadas 23 espécies, sendo duas partes diferentes de duas espécies particularmente, e obtidos extratos com três polaridades para cada uma, gerando 75 amostras para estudo. Apenas 26,7% apresentaram resultado positivo no pre-teste qualitativo de inibição da enzima AChE. Quando realizado o teste falso positivo, este número diminuiu para 30% do resultado positivo, sendo representado por 8% do total de amostras analisadas. Das 30 amostras analisadas quantitativamente, apenas 13,3% apresentaram fraca atividade inibitória da AChE, 43,3% apresentaram moderada atividade e 43,3%, apresentaram potente atividade, sempre levando-se em consideração a menor concentração estudada (0,5 mg/mL). Destacaram-se com melhores resultados Citrus limonum, Ricinus communis e Senna occidentalis, com porcentagem de inibição da atividade anticolinesterásica variando de 50% até 65%, na menor concentração. Estas espécies tiverem seus extratos de média e baixa polaridade submetidas a Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa. Foi possível perceber a presença de classes de compostos em comum entre as amostras, como os derivados de terpenoides e cumarinas, que em alguns estudos na literatura científica são citados com a atividade anticolinesterásica. Com maior frequência entre os melhores resultados, C. limonum foi escolhida para os testes de isolamento e doseamento de cumarinas, para o qual foram encontrados teores de 688,57 ±3,94 mg/g de extrato para fração de diclorometano. Ao ser particionada, esta amostra apresentou resultados de porcentagem de inibição anticolinesterásica entre 74,6% a 94,4%, sendo possível isolar o composto caracterizado como 2H-1-Benzopiran-2-ona-5,7-dimetoxi. As frações da amostra de metanol apresentaram inibição da AChE entre 92,3% e 100%. Os resultados obtidos para C. limonum mostram o potencial desta espécie para o tratamento da DA. / In Brazil, as well as in the world, there is an increase in the elderly population, and according to recent demographic research this increase is explained as a consequence of decreased fertility and mortality observed throughout the twentieth century. Age can be considered as one of the most accepted risk factors for the development of several diseases, for example Alzheimer's disease (AD). However, until today, a single cause cannot lead to the development of AD, but a set of factors, such as stress, physical injury (trauma or strokes), deficits in metabolism and brain vasculature that associated with cholinergic hypothesis could better explain the emergence of this disease. Currently, the treatment available for AD is mainly based on this assumption, it is not possible to cure, but the disease progression can be delayed, relieving the symptoms presented which in a certain way contributes to the patients‟ quality of life. However, in preclinical testing there are some candidates that could act on the formation of amyloid plaques and reduction of insoluble protein aggregates, which could prevent the disease progression to more severe stages. In the search for new drugs, natural products have relevance, and the endemic of some species of plants let them with anatomy and chemistry characteristics of that specific location. The Caatinga, for example, is a biome dominated by one type of vegetation which distribution is completely restricted to Brazil. Therefore, this study was aimed at seeking new substances with potential acetylcholinesterase activity, which could serve as an alternative for the treatment of AD, taking into consideration the cholinergic hypothesis as one of the main causes of the disease, starting from an ethnopharmacological research with medicinal plants used for diseases that could be related to the nervous system. Twenty-three species were collected, and it was obtained extracts with three polarities for each one, generating 75 samples to study. Only 26.7% were positive in the qualitative test of AChE enzyme. When the false positive test is performed this number decreases to 30% of the positive results, being represented by 8% of the total samples. From the 30 samples analyzed quantitatively, only 13.3% had weak inhibitory activity of AChE, 43.3% had moderate activity and 43.3% showed potent activity, always taking into account the lowest concentration studied (0.5 mg / mL). Those with the best results were Citrus limonum, Ricinus communis and Senna occidentalis, with percentage of inhibition of acetylcholinesterase activity varying from 50% to 65%, at lowest concentration. These species had their average and low polarity extracts subjected to Gas Chromatography-Mass Spectrometry. It was possible to perceive the presence of classes of compounds in common between the species, such as terpenes and coumarin, which in some studies in the scientific literature are cited with the activity in question. With a higher frequency among the best results, C. limonum was chosen for the isolation and dosing tests of Coumarins, in which were found levels of 688.57 ± 3.94 mg / g for fraction of extract of dichloromethane. By being partitioned, this sample showed results of acetylcholinesterase inhibition percentage of 74.6% to 94.4%, being possible to isolate the compound described as 2H-1-benzopyran-2one-5,7-dimethoxy. The fractions of methanol sample showed inhibiting between 92.3% and 100%. The results for C. limonum showed the potential of this species for the treatment of AD.

A lesão pulmonar aguda (LPA) é caracterizada por inflamação pulmonar de início súbito com recrutamento de polimorfonucleares e liberação de mediadores próinflamatórios. É uma condição grave que evolui com óbito em aproximadamente 40% dos casos. Diversos estudos que elucidaram a fisiopatologia da LPA, o tratamento ainda é insatisfatório. O sistema colinérgico anti-inflamatório foi descrito no pulmão e está relacionado a um reflexo via nervo vago que inibe a liberação de citocinas inflamatórias por efeitos relacionados a ação da acetilcolina em receptores nicotínicos. Nossa hipótese é de que a redução de VAChT, que está relacionada ao déficit na liberação de ACh, module a resposta inflamatória pulmonar em modelo de LPS. Objetivo: 1. Avaliar se a deficiência de VAChT modula a resposta pulmonar em animais geneticamente modificados; 2. Avaliar se a deficiência colinérgica induzida por redução de VAChT está envolvida na resposta pulmonar ao LPS e elucidar alguns mecanismos envolvidos; 3. Avaliar o potencial terapêutico do PNU, um agonista de alfa7nAChR nas alterações funcionais e histopatológicas em modelo de LPA em animais C57Bl6. Metodologia: Foram utilizados camundongos machos geneticamente modificados mutante (VAChT KDHOM) ou selvagem (WT) e C57BL/6. Inicialmente avaliamos a função pulmonar e a histopatologia pulmonar em animais VAChT KDHOM. Após, animais WT e VAChT KDHOM receberam instilação intranasal de LPS ou salina e a resposta inflamatória foi avaliada de 1,5h até 72 horas após. Ainda, foi avaliado a resposta pulmonar em VAChT KDHOM e WT após a instilação de LPS intraperitoneal. Por fim, animais C57BL/6 instilados com LPS intranasal, receberam tratamento prévio ou após com PNU, agonista do receptor nicotínico alfa7. Resultados: Animais mutante apresentaram maior quantidade de células recuperadas no lavado bronco alveolar (LBA) e aumento de citocinas próinflamatórias, aumento de edema peribrônquico e piora da função pulmonar. Ainda, observamos aumento da expressão de NF-kB e redução de JAK2. A deficiência de VAChT induziu aumento de células inflamatórias em animais que receberam LPS somente em 1.5h após a indução, sendo os valores iguais ao dos animais WT em 24 e 72 horas. Nos animais WT, o estimulo do receptor nicotínico melhora a inflamação, enquanto o estímulo de receptores muscarínicos parece contribuir com a piora da resposta da inflamação pulmonar. Os efeitos do PNU parecem que dependem da via colinérgica intacta, uma vez que esta droga não teve o mesmo efeito em animais mutante. Entretanto, o tratamento com PNU em animais C57BL/6 reduziu a inflamação, a produção de citocinas, a deposição de colágeno no tecido pulmonar e os níveis de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, melhorando a função pulmonar. Estes efeitos parecem estar associados a redução de macrófagos perfil M1, e a inibição de NF-kB. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o sistema colinérgico anti-inflamatório está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar, seja na manutenção da homeostasia ou ainda nas fases iniciais do desenvolvimento da LPA. Ainda, está claro que o estímulo de receptores nicotínicos tem grande potencial como alvo terapêutico a ser explorado na SDRA / Acute lung injury (ALI) is characterized by acute lung inflammation with recruitment of polymorphonuclear and release of proinflammatory mediators. It is a severe condition since leads to death 40% of the cases. Several studies have elucidated the pathophysiology of ALI, however the treatment is still unsatisfactory. The anti-inflammatory cholinergic system was described in the lung and is related to a vagal nerve reflex that inhibits the release of inflammatory cytokines by the action o ACh on nicotinic receptors. Our hypothesis is that the VAChT reduction, which is related to the deficit in the release of ACh, modulates the pulmonary inflammatory response in a model of LPS. Aim: 1. To assess whether VAChT deficiency modulates the pulmonary response in genetically modified animals; 2. Assess whether cholinergic deficiency induced reduction VAChT is involved in pulmonary response to LPS and elucidate some mechanisms involved; 3. To evaluate the therapeutic potential of PNU, an agonist alfa7nAChR, in functional and histological changes in C57BL6 mice with LPA. Methods: Mutant genetically modified male mice (VAChT KDHOM) or wild (WT) and C57BL/6 were used. First, we evaluated lung function and lung histopathology in VAChT KDHOM animals. After, WT animals and VAChT KDHOM received intranasal instillation of LPS or saline and the inflammatory response was assessed 1.5 hours to 72 hours. Moreover, the pulmonary response was evaluated in WT and VAChT KDHOM after instillation of LPS intraperitoneally. Finally, C57BL6 instilled with intranasal LPS received prior or post-treatment with PNU, an alfa7 nicotinic receptor agonist. Results: Mutant animals had higher number of cells recovered in brochoalveolar lavage (BAL) and increased pro-inflammatory cytokines, peribronchial edema and worsening of lung function. Still, there was an increase of NF_kB expression and reduction of JAK2. The VAChT deficiency induced increase in inflammatory cells in animals receiving LPS only 1.5h after the LPS instilation, and the values were similar to WT in 24 and 72 hours. In WT mice, the stimulation of the nicotinic receptor improves inflammation, while the stimulation of muscarinic receptors appears to contribute to the worsening of the pulmonary inflammatory response. The effects of PNU seem to depend on the intact cholinergic pathway, since this drug had no effects on mutant animals. However, treatment with PNU in C57BL6 reduced pulmonar inflammation, cytokine production, collagen deposition in lung tissue and the levels of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1, improving pulmonary function. These effects appear to be associated with reduced profile M1 macrophages and the inhibition of NF-kB. Conclusion: These data clearly demonstrate that the anti-inflammatory cholinergic system is involved in the control of lung inflammatory response, both to maintain the lung homeostasis or in the early stages of the development of ALI. Finally, it is clear that the stimulation of nicotinic receptors has great potential as a therapeutic target to be explored in ARDS

A lesão pulmonar aguda (LPA) é caracterizada por inflamação pulmonar de início súbito com recrutamento de polimorfonucleares e liberação de mediadores próinflamatórios. É uma condição grave que evolui com óbito em aproximadamente 40% dos casos. Diversos estudos que elucidaram a fisiopatologia da LPA, o tratamento ainda é insatisfatório. O sistema colinérgico anti-inflamatório foi descrito no pulmão e está relacionado a um reflexo via nervo vago que inibe a liberação de citocinas inflamatórias por efeitos relacionados a ação da acetilcolina em receptores nicotínicos. Nossa hipótese é de que a redução de VAChT, que está relacionada ao déficit na liberação de ACh, module a resposta inflamatória pulmonar em modelo de LPS. Objetivo: 1. Avaliar se a deficiência de VAChT modula a resposta pulmonar em animais geneticamente modificados; 2. Avaliar se a deficiência colinérgica induzida por redução de VAChT está envolvida na resposta pulmonar ao LPS e elucidar alguns mecanismos envolvidos; 3. Avaliar o potencial terapêutico do PNU, um agonista de alfa7nAChR nas alterações funcionais e histopatológicas em modelo de LPA em animais C57Bl6. Metodologia: Foram utilizados camundongos machos geneticamente modificados mutante (VAChT KDHOM) ou selvagem (WT) e C57BL/6. Inicialmente avaliamos a função pulmonar e a histopatologia pulmonar em animais VAChT KDHOM. Após, animais WT e VAChT KDHOM receberam instilação intranasal de LPS ou salina e a resposta inflamatória foi avaliada de 1,5h até 72 horas após. Ainda, foi avaliado a resposta pulmonar em VAChT KDHOM e WT após a instilação de LPS intraperitoneal. Por fim, animais C57BL/6 instilados com LPS intranasal, receberam tratamento prévio ou após com PNU, agonista do receptor nicotínico alfa7. Resultados: Animais mutante apresentaram maior quantidade de células recuperadas no lavado bronco alveolar (LBA) e aumento de citocinas próinflamatórias, aumento de edema peribrônquico e piora da função pulmonar. Ainda, observamos aumento da expressão de NF-kB e redução de JAK2. A deficiência de VAChT induziu aumento de células inflamatórias em animais que receberam LPS somente em 1.5h após a indução, sendo os valores iguais ao dos animais WT em 24 e 72 horas. Nos animais WT, o estimulo do receptor nicotínico melhora a inflamação, enquanto o estímulo de receptores muscarínicos parece contribuir com a piora da resposta da inflamação pulmonar. Os efeitos do PNU parecem que dependem da via colinérgica intacta, uma vez que esta droga não teve o mesmo efeito em animais mutante. Entretanto, o tratamento com PNU em animais C57BL/6 reduziu a inflamação, a produção de citocinas, a deposição de colágeno no tecido pulmonar e os níveis de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, melhorando a função pulmonar. Estes efeitos parecem estar associados a redução de macrófagos perfil M1, e a inibição de NF-kB. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o sistema colinérgico anti-inflamatório está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar, seja na manutenção da homeostasia ou ainda nas fases iniciais do desenvolvimento da LPA. Ainda, está claro que o estímulo de receptores nicotínicos tem grande potencial como alvo terapêutico a ser explorado na SDRA / Acute lung injury (ALI) is characterized by acute lung inflammation with recruitment of polymorphonuclear and release of proinflammatory mediators. It is a severe condition since leads to death 40% of the cases. Several studies have elucidated the pathophysiology of ALI, however the treatment is still unsatisfactory. The anti-inflammatory cholinergic system was described in the lung and is related to a vagal nerve reflex that inhibits the release of inflammatory cytokines by the action o ACh on nicotinic receptors. Our hypothesis is that the VAChT reduction, which is related to the deficit in the release of ACh, modulates the pulmonary inflammatory response in a model of LPS. Aim: 1. To assess whether VAChT deficiency modulates the pulmonary response in genetically modified animals; 2. Assess whether cholinergic deficiency induced reduction VAChT is involved in pulmonary response to LPS and elucidate some mechanisms involved; 3. To evaluate the therapeutic potential of PNU, an agonist alfa7nAChR, in functional and histological changes in C57BL6 mice with LPA. Methods: Mutant genetically modified male mice (VAChT KDHOM) or wild (WT) and C57BL/6 were used. First, we evaluated lung function and lung histopathology in VAChT KDHOM animals. After, WT animals and VAChT KDHOM received intranasal instillation of LPS or saline and the inflammatory response was assessed 1.5 hours to 72 hours. Moreover, the pulmonary response was evaluated in WT and VAChT KDHOM after instillation of LPS intraperitoneally. Finally, C57BL6 instilled with intranasal LPS received prior or post-treatment with PNU, an alfa7 nicotinic receptor agonist. Results: Mutant animals had higher number of cells recovered in brochoalveolar lavage (BAL) and increased pro-inflammatory cytokines, peribronchial edema and worsening of lung function. Still, there was an increase of NF_kB expression and reduction of JAK2. The VAChT deficiency induced increase in inflammatory cells in animals receiving LPS only 1.5h after the LPS instilation, and the values were similar to WT in 24 and 72 hours. In WT mice, the stimulation of the nicotinic receptor improves inflammation, while the stimulation of muscarinic receptors appears to contribute to the worsening of the pulmonary inflammatory response. The effects of PNU seem to depend on the intact cholinergic pathway, since this drug had no effects on mutant animals. However, treatment with PNU in C57BL6 reduced pulmonar inflammation, cytokine production, collagen deposition in lung tissue and the levels of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1, improving pulmonary function. These effects appear to be associated with reduced profile M1 macrophages and the inhibition of NF-kB. Conclusion: These data clearly demonstrate that the anti-inflammatory cholinergic system is involved in the control of lung inflammatory response, both to maintain the lung homeostasis or in the early stages of the development of ALI. Finally, it is clear that the stimulation of nicotinic receptors has great potential as a therapeutic target to be explored in ARDS

INTRODUÇÃO: A Asma Brônquica é caracterizada por obstrução ao fluxo aéreo, reversível ou não, e processo inflamatório pulmonar, caracterizado principalmente por eosinofilia. A persistência da inflamação pode induzir processo de reparo pulmonar associado à redução progressiva da função pulmonar. A recente descrição do sistema colinérgico anti-inflamatório, um mecanismo neural que suprime a resposta imune inata e controla a inflamação por inibição de citocinas proinflammatórias, e a detecção de alguns de seus componentes em células de vias aéreas sugerem uma importante participação deste sistema na fisiopatologia de doenças pulmonares. O principal mediador deste sistema é a acetilcolina (ACh), que é estocada em vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de ACh (VAChT), proteína essencial para sua liberação. OBJETIVOS: Avaliar os efeitos da deficiência colinérgica por redução da VAChT nas alterações pulmonares observadas em modelo experimental de inflamação pulmonar induzida pela exposição crônica a ovoalbumina. METODOLOGIA: A redução colinérgica foi induzida pela modificação genética nos níveis de VAChT. Camundongos machos selvagens e mutantes foram submetidos ao protocolo de sensibilização subcutânea com ovoalbumina ou salina nos dias 0, 7 e 14. Após, foram submetidos a desafios inalatórios com ovalbumina a 1% ou inalações de salina por 20 minutos nos dias 26, 27 e 28. No dia 29, foi realizada a avaliação da mecânica pulmonar, da inflamação no lavado broncoalveolar e no tecido e análise histológica de remodelamento e expressão de MMP-9 e TIMP-1 por imunohistoquímica. Também foi quantificado por ELISA níveis de IL-4, IL-10 e de TNF-a no homogenato pulmonar. A análise estatística considerou um p<0,05 como significativo. RESULTADOS: Animais sensibilizados apresentaram hyperresponsividade brônquica, inflamação e edema peribrônquico e deposição de fibras colágenas e elásticas ao redor das vias aéreas comparado ao grupo salina (p<0,05). Além disso houve aumento de IL-4 no homogenato pulmonar e da expressão de MMP-9 e TIMP-1 nas células inflamatórias. Os animais mutantes, independente de serem ou não sensibilizados, apresentaram aumento de TNF-a no pulmão. Os animais mutantes que foram submetidos ao protocolo de sensibilização mostraram aumento da hiperresponsividade brônquica, do eosinófilos, do edema e da deposição de colágeno comparado aos animais selvagens que também foram sensibilizados com ovoalbumina. Estas alterações podem ser atribuídas ao aumento de IL-4 e de MMP-9/TIMP-1 que foi observado nos animais mutantes e sensibilizada em comparação com o os selvagens sensibilizados. Não houve diferença nos níveis de IL-10 nos grupos experimentais. Conclusão: A deficiência colinérgica piora a hiperresponsividade brônquica, a inflamação eosinofílica e o remodelamento, principalmente por interferir com a citocina pró-inflamatória IL-4 e na proporção de MMP-9 e TIMP-1. Estes dados sugerem que a via colinérgica antiinflamatória está envolvida na fisiopatogenia da asma e necessita ser mais investigada / BACKGROUND: Bronchial asthma is characterized by reversible or not airflow obstruction and pulmonary inflammation, mainly characterized by eosinophilia. The persistence of inflammation can induce lung repair process associated with progressive reduction in lung function. Recent evidence of the cholinergic anti-inflammatory system, a neural mechanism that suppresses the innate immune response and control inflammation by proinflammatory cytokines inhibition, and the detection of some of its components in airway cells suggest an important role of this system in pulmonary physiopathology. The main mediator of this system is acetylcholine (ACh), which is stored in synaptic vesicles by vesicular acetylcholine transporter (VAChT), an essential protein for ACh release. AIMS: To evaluate the effects of cholinergic deficiency by VAChT reduction on pulmonary alterations observed in an experimental model of pulmonary inflammation induced by chronic exposure to ovalbumin. METHODS: The cholinergic deficiency was induced by genetic modification on VAChT levels. Wild-type and mutant male mice were submitted to subcutaneous ovalbumin sensitization or saline protocol on days 0, 7 and 14. After, animals were submitted to inhalation challenge with ovalbumin 1% or saline for 20 minutes on days 26, 27 and 28. On day 29, we evaluated the pulmonary mechanics, inflammation in bronchoalveolar lavage and in airways, histological analysis of airway remodeling and the expression of MMP-9 and TIMP-1 by immunohistochemistry. It was also quantified by the levels of IL-4, IL-10 and TNF-a in lung homogenate. The statistical analysis were performed and a p<0.05 was considered significant. RESULTS: Sensitized animals presented bronchial hyperresponsividade, airway inflammation and edema and collagen and elastic fibers deposition of collagen and elastic fibers around the airways compared to saline group (p <0.05). Furthermore, there was an increase of IL-4 in lung homogenate and the expression of MMP-9 and TIMP-1 in inflammatory cells. The mutant animals, regardless the sensitization, showed an increase in lung content of TNF-a. The mutant and sensitized animals showed an increase in bronchial hyperresponsiveness, in eosinophils, edema and collagen deposition in airways compared to the wild type and sensitized animals. These changes can be attributed to increased IL-4 and MMP-9/TIMP-1 that were observed in mutant and sensitized animals. There was no difference in levels of IL-10 in the experimental groups. Conclusion: The cholinergic deficiency worsens bronchial hyperresponsiveness, eosinophilic inflammation, and airway remodeling mainly by interfering with the pro-inflammatory cytokine IL-4 and in MMP-9/TIMP-1 ratio. These data suggest that anti-inflammatory cholinergic pathway is involved in the asthma pathogenesis deserves further investigation

Introdução: O enfisema pulmonar é o maior componente da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), é caracterizado pelo alargamento, destruição alveolar e inflamação do parênquima e vias aéreas pulmonares. A recente descrição do sistema colinérgico anti-inflamatório, um mecanismo neural que controla a inflamação por inibição de citocinas pró-inflamatórias, sugere uma importante participação deste sistema na fisiopatologia das doenças pulmonares. A acetilcolina (ACh), principal mediador deste sistema, é estocada em vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de ACh (VAChT), proteína essencial para sua liberação na fenda sináptica. Objetivos: Avaliar se os efeitos da hipofunção colinérgica, por redução da expressão do VAChT, interferem com as alterações pulmonares em modelo experimental de enfisema pulmonar. Metodologia: Camundongos machos selvagens e mutantes, estes últimos com redução da função colinérgica por modificação genética nos níveis do VAChT, foram submetidos ao protocolo de elastase (PPE instilação nasal) ou salina. No dia 28, foi avaliado a função pulmonar, a inflamação e o remodelamento pulmonar. Por imunohistoquímica, avaliou-se a expressão de macrófago, NF-kB e isoprostano no pulmão. Algumas citocinas pró-inflamatórias foram avaliadas no homogenato pulmonar pelo Bioplex. Resultados: Animais selvagem que receberam elastase tiveram redução de elastância de tecido, aumento da inflamação no LBA e no tecido, aumento de citocinas pró-inflamatórias e IL-10, aumento do remodelamento pulmonar, e da expressão de NF-kB e de isoprostano. A deficiência colinérgica nestes animais submetidos ao mesmo protocolo de elastase amplificou a resposta inflamatória (macrófago e neutrófilo) no pulmão, níveis de MCP-1 e também aumento células positivas para NF-kB e isoprostano na região do eixo broncovascular. Conclusão: A ACh parece ter um papel protetor da inflamação neste modelo de enfisema pulmonar, pelo menos em parte pelo controle do NF-kB e do estresse oxidativo. Estes resultados sugerem ainda que o remodelamento e a função pulmonar no enfisema experimental não dependem totalmente do grau de inflamação pulmonar / Banckground: Pulmonary emphysema is a major component of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), is characterized by enlargement, alveolar destruction and inflammation of the airways and lung tissue. The recent description of the cholinergic anti-inflammatory, a neural mechanism that controls inflammation by inhibition of proinflammatory cytokines, suggests an important role of this system in the pathophysiology of lung disease. The main mediator of this system is acetylcholine (ACh), which is stored in synaptic vesicles by vesicular acetylcholine transporter (VAChT) protein, which is essential for ACh release into the synaptic cleft. Aim: To evaluate whether the effects of cholinergic hypofunction by reduction on VAChT expression, interferes with pulmonary alterations in an experimental model of pulmonary emphysema. Methods: Male mice wild-type and mutant, the last one with reduced cholinergic function by genetic modification in the levels of VAChT, were submitted to the protocol of elastase (PPE intranasally) or saline. On day 28, pulmonary mechanics, inflammation in bronchoalveolar lavage fluid and tissue remodeling were analyzed. By immunohistochemistry, the expression of macrophage, NF-kB and isoprostane in lung was evaluated. Some proinflammatory cytokines were measured in lung homogenate by Bio Plex. Results: Wild-Type animals that received elastase presented a reduction in tissue elastance, an increase in BALF and tissue inflammation as well as in proinflammatory cytokines, IL-10, pulmonary remodeling, and expression of NF-kB and isoprostane. Cholinergic deficient in these animals submitted to the same elastase-induced emphysema protocol amplified the inflammatory response (macrophage and neutrophils) in the lungs, the levels of MCP-1 and the number of positive cells to NF-kB and isoprostane in bronchovascular axis. Conclusions: The ACh seems to have a protective role inflammation in this experimental model of emphysema, at least in part by controlling NF-kB and oxidative stress. These results further suggest that the remodeling and lung function in experimental emphysema does not depend entirely on the degree of lung inflammation

INTRODUÇÃO: A Asma Brônquica é caracterizada por obstrução ao fluxo aéreo, reversível ou não, e processo inflamatório pulmonar, caracterizado principalmente por eosinofilia. A persistência da inflamação pode induzir processo de reparo pulmonar associado à redução progressiva da função pulmonar. A recente descrição do sistema colinérgico anti-inflamatório, um mecanismo neural que suprime a resposta imune inata e controla a inflamação por inibição de citocinas proinflammatórias, e a detecção de alguns de seus componentes em células de vias aéreas sugerem uma importante participação deste sistema na fisiopatologia de doenças pulmonares. O principal mediador deste sistema é a acetilcolina (ACh), que é estocada em vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de ACh (VAChT), proteína essencial para sua liberação. OBJETIVOS: Avaliar os efeitos da deficiência colinérgica por redução da VAChT nas alterações pulmonares observadas em modelo experimental de inflamação pulmonar induzida pela exposição crônica a ovoalbumina. METODOLOGIA: A redução colinérgica foi induzida pela modificação genética nos níveis de VAChT. Camundongos machos selvagens e mutantes foram submetidos ao protocolo de sensibilização subcutânea com ovoalbumina ou salina nos dias 0, 7 e 14. Após, foram submetidos a desafios inalatórios com ovalbumina a 1% ou inalações de salina por 20 minutos nos dias 26, 27 e 28. No dia 29, foi realizada a avaliação da mecânica pulmonar, da inflamação no lavado broncoalveolar e no tecido e análise histológica de remodelamento e expressão de MMP-9 e TIMP-1 por imunohistoquímica. Também foi quantificado por ELISA níveis de IL-4, IL-10 e de TNF-a no homogenato pulmonar. A análise estatística considerou um p<0,05 como significativo. RESULTADOS: Animais sensibilizados apresentaram hyperresponsividade brônquica, inflamação e edema peribrônquico e deposição de fibras colágenas e elásticas ao redor das vias aéreas comparado ao grupo salina (p<0,05). Além disso houve aumento de IL-4 no homogenato pulmonar e da expressão de MMP-9 e TIMP-1 nas células inflamatórias. Os animais mutantes, independente de serem ou não sensibilizados, apresentaram aumento de TNF-a no pulmão. Os animais mutantes que foram submetidos ao protocolo de sensibilização mostraram aumento da hiperresponsividade brônquica, do eosinófilos, do edema e da deposição de colágeno comparado aos animais selvagens que também foram sensibilizados com ovoalbumina. Estas alterações podem ser atribuídas ao aumento de IL-4 e de MMP-9/TIMP-1 que foi observado nos animais mutantes e sensibilizada em comparação com o os selvagens sensibilizados. Não houve diferença nos níveis de IL-10 nos grupos experimentais. Conclusão: A deficiência colinérgica piora a hiperresponsividade brônquica, a inflamação eosinofílica e o remodelamento, principalmente por interferir com a citocina pró-inflamatória IL-4 e na proporção de MMP-9 e TIMP-1. Estes dados sugerem que a via colinérgica antiinflamatória está envolvida na fisiopatogenia da asma e necessita ser mais investigada / BACKGROUND: Bronchial asthma is characterized by reversible or not airflow obstruction and pulmonary inflammation, mainly characterized by eosinophilia. The persistence of inflammation can induce lung repair process associated with progressive reduction in lung function. Recent evidence of the cholinergic anti-inflammatory system, a neural mechanism that suppresses the innate immune response and control inflammation by proinflammatory cytokines inhibition, and the detection of some of its components in airway cells suggest an important role of this system in pulmonary physiopathology. The main mediator of this system is acetylcholine (ACh), which is stored in synaptic vesicles by vesicular acetylcholine transporter (VAChT), an essential protein for ACh release. AIMS: To evaluate the effects of cholinergic deficiency by VAChT reduction on pulmonary alterations observed in an experimental model of pulmonary inflammation induced by chronic exposure to ovalbumin. METHODS: The cholinergic deficiency was induced by genetic modification on VAChT levels. Wild-type and mutant male mice were submitted to subcutaneous ovalbumin sensitization or saline protocol on days 0, 7 and 14. After, animals were submitted to inhalation challenge with ovalbumin 1% or saline for 20 minutes on days 26, 27 and 28. On day 29, we evaluated the pulmonary mechanics, inflammation in bronchoalveolar lavage and in airways, histological analysis of airway remodeling and the expression of MMP-9 and TIMP-1 by immunohistochemistry. It was also quantified by the levels of IL-4, IL-10 and TNF-a in lung homogenate. The statistical analysis were performed and a p<0.05 was considered significant. RESULTS: Sensitized animals presented bronchial hyperresponsividade, airway inflammation and edema and collagen and elastic fibers deposition of collagen and elastic fibers around the airways compared to saline group (p <0.05). Furthermore, there was an increase of IL-4 in lung homogenate and the expression of MMP-9 and TIMP-1 in inflammatory cells. The mutant animals, regardless the sensitization, showed an increase in lung content of TNF-a. The mutant and sensitized animals showed an increase in bronchial hyperresponsiveness, in eosinophils, edema and collagen deposition in airways compared to the wild type and sensitized animals. These changes can be attributed to increased IL-4 and MMP-9/TIMP-1 that were observed in mutant and sensitized animals. There was no difference in levels of IL-10 in the experimental groups. Conclusion: The cholinergic deficiency worsens bronchial hyperresponsiveness, eosinophilic inflammation, and airway remodeling mainly by interfering with the pro-inflammatory cytokine IL-4 and in MMP-9/TIMP-1 ratio. These data suggest that anti-inflammatory cholinergic pathway is involved in the asthma pathogenesis deserves further investigation