Introdução: O enfisema pulmonar é o maior componente da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), é caracterizado pelo alargamento, destruição alveolar e inflamação do parênquima e vias aéreas pulmonares. A recente descrição do sistema colinérgico anti-inflamatório, um mecanismo neural que controla a inflamação por inibição de citocinas pró-inflamatórias, sugere uma importante participação deste sistema na fisiopatologia das doenças pulmonares. A acetilcolina (ACh), principal mediador deste sistema, é estocada em vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de ACh (VAChT), proteína essencial para sua liberação na fenda sináptica. Objetivos: Avaliar se os efeitos da hipofunção colinérgica, por redução da expressão do VAChT, interferem com as alterações pulmonares em modelo experimental de enfisema pulmonar. Metodologia: Camundongos machos selvagens e mutantes, estes últimos com redução da função colinérgica por modificação genética nos níveis do VAChT, foram submetidos ao protocolo de elastase (PPE instilação nasal) ou salina. No dia 28, foi avaliado a função pulmonar, a inflamação e o remodelamento pulmonar. Por imunohistoquímica, avaliou-se a expressão de macrófago, NF-kB e isoprostano no pulmão. Algumas citocinas pró-inflamatórias foram avaliadas no homogenato pulmonar pelo Bioplex. Resultados: Animais selvagem que receberam elastase tiveram redução de elastância de tecido, aumento da inflamação no LBA e no tecido, aumento de citocinas pró-inflamatórias e IL-10, aumento do remodelamento pulmonar, e da expressão de NF-kB e de isoprostano. A deficiência colinérgica nestes animais submetidos ao mesmo protocolo de elastase amplificou a resposta inflamatória (macrófago e neutrófilo) no pulmão, níveis de MCP-1 e também aumento células positivas para NF-kB e isoprostano na região do eixo broncovascular. Conclusão: A ACh parece ter um papel protetor da inflamação neste modelo de enfisema pulmonar, pelo menos em parte pelo controle do NF-kB e do estresse oxidativo. Estes resultados sugerem ainda que o remodelamento e a função pulmonar no enfisema experimental não dependem totalmente do grau de inflamação pulmonar / Banckground: Pulmonary emphysema is a major component of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), is characterized by enlargement, alveolar destruction and inflammation of the airways and lung tissue. The recent description of the cholinergic anti-inflammatory, a neural mechanism that controls inflammation by inhibition of proinflammatory cytokines, suggests an important role of this system in the pathophysiology of lung disease. The main mediator of this system is acetylcholine (ACh), which is stored in synaptic vesicles by vesicular acetylcholine transporter (VAChT) protein, which is essential for ACh release into the synaptic cleft. Aim: To evaluate whether the effects of cholinergic hypofunction by reduction on VAChT expression, interferes with pulmonary alterations in an experimental model of pulmonary emphysema. Methods: Male mice wild-type and mutant, the last one with reduced cholinergic function by genetic modification in the levels of VAChT, were submitted to the protocol of elastase (PPE intranasally) or saline. On day 28, pulmonary mechanics, inflammation in bronchoalveolar lavage fluid and tissue remodeling were analyzed. By immunohistochemistry, the expression of macrophage, NF-kB and isoprostane in lung was evaluated. Some proinflammatory cytokines were measured in lung homogenate by Bio Plex. Results: Wild-Type animals that received elastase presented a reduction in tissue elastance, an increase in BALF and tissue inflammation as well as in proinflammatory cytokines, IL-10, pulmonary remodeling, and expression of NF-kB and isoprostane. Cholinergic deficient in these animals submitted to the same elastase-induced emphysema protocol amplified the inflammatory response (macrophage and neutrophils) in the lungs, the levels of MCP-1 and the number of positive cells to NF-kB and isoprostane in bronchovascular axis. Conclusions: The ACh seems to have a protective role inflammation in this experimental model of emphysema, at least in part by controlling NF-kB and oxidative stress. These results further suggest that the remodeling and lung function in experimental emphysema does not depend entirely on the degree of lung inflammation

A glândula pineal sintetiza o hormônio melatonina no período escuro. No rato, a ativação dos receptores a e b-adrenérgicos aumenta os níveis de AMPc, levando à síntese e ativação da enzima arilalquilamina-N-acetiltransferase (AANAT). A glândula recebe também inervação parassimpática, sendo inibitório o efeito da acetilcolina. A metilecgonidina (AEME) é o produto da pirólise da cocaína, quando esta é usada sob a forma de \"crack\". Neste trabalho estudamos os efeitos e os mecanismos de ação da AEME sobre a síntese da melatonina. Foram investigados a atividade da AANAT, o Ca2+, o AMPc e a viabilidade celular e a fragmentação do DNA. A AEME reduziu a síntese da melatonina in vivo e in vitro, sendo este efeito revertido pela atropina. A AEME induziu um aumento do Ca2+, não alterando o AMPc e a atividade da AANAT. A viabilidade celular e fragmentação do DNA não foram modificadas pela AEME. Em conclusão, a AEME reduz a síntese da melatonina, in vitro e in vivo, e a sua ação se dá por interferir com o sistema colinérgico muscarínico. / The pineal gland synthesizes the hormone melatonin in the dark. In rats, the activation of a and b-adrenergic receptors increases cAMP levels and the synthesis and activity of arylalkylamine-N-acetyltransferase enzyme (AANAT). The pineal gland is also innervated by parasympathetic fibers, being inhibitory the effect of acetylcholine. Methylecgonidine (AEME) is the pyrolysis product of cocaine when it is used as \"crack.\" In this work we studied the effects of AEME on the melatonin synthesis, in vitro and in vivo. We investigated AANAT activity, iCa2+, cAMP, cell viability and DNA fragmentation. AEME reduced melatonin synthesis in vivo and in vitro, and this effect was reversed by atropine. There was an increase in Ca2+, but not in cAMP or AANAT activity induced by AEME. Cell viability and DNA fragmentation were not affected by AEME. In conclusion, AEME reduced melatonin synthesis in vitro and in vivo, being this effect mediated by the muscarinic cholinergic system.

A farmacodependência é considerada uma doença crônica e sujeita à recaídas, na qual o indivíduo perde o controle sob a utilização de determinada droga de abuso. Conforme o usuário persiste com o uso da droga, ocorrem alterações anatômicas, fisiológicas e neuroquímicas no sistema nervoso central (SNC), as quais podem culminar no desenvolvimento de um comportamento compulsivo. A neurobiologia deste processo é complexa e envolve mecanismos de plasticidade em diferentes sistemas neurotransmissores. O principal deles é o sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, constituído por neurônios da área ventral do tegmento mesencefálico (VTA) que se projetam para o núcleo accumbens (NAc) e ao córtex pré-frontal (CPF), diretamente relacionado aos processos motivação e recompensa. Contudo, o mesmo não é suficiente para elucidar a complexidade da doença, o que levou ao entendimento da presença de outros sistemas neurotransmissores neste processo. Sabe-se que o sistema colinérgico muscarínico está diretamente envolvido em diferentes doenças neuropsiquiátricas, incluindo a farmacodependência. Além disso, os receptores colinérgicos muscarínicos (mAChRs) estão densamente presentes em regiões límbicas, onde acetilcolina e dopamina interagem por neuromodulação. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi investigar as possíveis alterações plásticas no sistema colinérgico muscarínico resultantes de tratamentos com cocaína que mimetizaram o consumo compulsivo humano. Para tanto, foram realizados ensaios comportamentais com camundongos Swiss machos adultos em campo aberto, tratados durante um (acute binge paradigm, 30 mg/kg) ou 14 dias (escalating dose binge paradigm, 15 - 30 mg/kg) com cocaína. Os animais receberam 3 injeções intraperitoneais (i.p.) de cocaína com intervalos de 60 minutos, durante os quais a atividade locomotora foi avaliada. Após a análise comportamental, os animais foram eutanasiados por decapitação para a remoção do encéfalo e dissecação do estriado, CPF e hipocampo, regiões cerebrais cruciais para o processo fisiopatológico da farmacodependência. Componentes do sistema dopaminérgico (receptores D1 e D2) e colinérgico muscarínico (M1-M5 mAChRs, ChAT, VAChT e AChE) foram avaliados por Immunoblotting. O sangue dos animais foi coletado para a realização das dosagens de cocaína e benzoeilecgonidina por UPLC-MS/MS. O desempenho locomotor total dos animais tratados com cocaína foi superior ao dos animais controle. O grupo tratado com escalonamento de dose desenvolveu sensibilização comportamental aos efeitos psicoestimulantes da cocaína no segundo dia de tratamento e, a partir dele, a atividade locomotora total manteve a mesma magnitude. Além disso, conforme o aumento da dose, os animais mantiveram um nível de atividade superior ao basal, mesmo após o término do experimento. As análises de Immunoblotting mostraram alterações dopaminérgicas e colinérgicas. No estriado observou-se redução da densidade de D2R após o tratamento de 14 dias e aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. Já no hipocampo observou-se redução de D1R e aumento de D2R, M1 e M5 mAChR após o tratamento crônico; e um aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. No CPF, foi evidenciada redução de M3 e de M5 mAChR após o tratamento cônico de 14 dias. Em relação às moléculas colinérgicas, observou-se, após o tratamento crônico, aumento da quantidade de ChAT em todas as estruturas estudadas. Além disso, VAChT mostrou-se aumentado no hipocampo após ambos os tratamentos. As dosagens plasmáticas revelaram a presença de 20,38 ± 3,4 ng/mL de cocaína e 224,6 ± 24,02 ng/mL de benzoilcgonina (BZE) nos animais do grupo agudo e, nos do grupo crônico, 62,26 ± 10,56 ng/mL e 375,1 ± 25,62 ng/mL de cocaína e BZE respectivamente. / Drug addiction is a chronic releapsing disorder characterized by the loss of control in limiting drug intake. As the drug use persists, anatomical, physiological and neurochemical changes occur in the central nervous system (CNS), which may lead to the development of compulsive behaviors. The neurobiology of this process is complex and involves mechanisms of plasticity in different neurotransmitter systems. The main one is the mesocorticolimbic dopaminergic system, composed by neurons from the ventral tegmental area (VTA) that projects to the nucleus accumbens (NAc), which is directly related to motivation and reward processes. However, just dopamine is not enough to elucidate the complexity of the disease, leading to the comprehension of another neurotransmitters system involved. It is known that the cholinergic system is involved in different neuropsychiatric disorders, including drug addiction. Furthermore, cholinergic muscarinic receptors (mAChRs) are densely present in limbic regions, where acetylcholine and dopamine interact by neuromodulation. Considering that, the aim of this study was to evaluate the existence of neuroadaptative changes in the cholinergic muscarinic system induced by cocaine in a compulsive-like behavior model in mice. Swiss-Webster adult male mice received 3 daily injections (i.p) of cocaine or saline, with a 60-min interval among them, either acutely (acute binge paradigm) or for 14 consecutive days (escalating dose binge paradigm). The locomotor activity was monitored in the open field during 60 min, in 5 min bins, after each injection. After behavioral analysis animals were euthanized by decapitation and the brain regions of striatum, hippocampus and prefrontal cortex, involved in the pathophysiology of addiction were dissected. Dopaminergic receptors (D1R and D2R), cholinergic muscarinic receptors (M1-M5 mAChRs), choline acetylytransferase (ChAT), acetylcholine vesicular transporter and acetylcholinesterase (AChE) were quantified by Immunoblotting. Blood samples were collected with heparin and plasma was separated and stored with 2% sodium fluorite at -80ºC for cocaine and benzoilecgonine quantification by UPLC-MS/MS. In the open field, animals treated with cocaine showed an increase in locomotor activity compared to control. Cocaine induced behavioral sensitization, in the escalating dose group on day 2, and after that the locomotor activity had the same magnitude until day 14th. These animals also kept the locomotor activity elevated even after the last injection. Immunobltting shows dopaminergic and cholinergic changes. An increase in M3 was observed in both hippocampus and striatum of animals acutely treated. After 14 days, there was an increase in M1, M5 and D2 and a decrease in D1 in hippocampus. There was also a decrease in D2 in the striatum; and finally, there was a decrease in M5 and M3 in the prefrontal cortex. ChAT densities were higher in all regions after the chronic treatment. Besides that, VAChT were higher in the hippocampus after both acute and chronic treatments. UPLC-MS/MS for cocaine and benzoilecgonine demonstrated the presence of 20,38 ± 3,4 ng/mL of cocaine and 224,6 ± 24,02 ng/mL of BZE in the acute binge group; and, 62,26 ± 10,56 ng/mL and 375,1 ± 25,62 ng/mL of cocaine and BZE, respectively in the escalating dose animals.

A sepse é caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró- e anti-inflamatória às infecções. Um dos principais componentes da resposta do hospedeiro no choque séptico são as interações recíprocas entre o sistema imune e o sistema nervoso central, desta forma o objetivo deste estudo foi investigar o desenvolvimento de alterações neurológicas e sua associação com alterações imunológicas em fases iniciais e tardias após a sepse por ligação e perfuração cecal (CLP). Dividimos em três experimentos: agudo, crônico e efeito da ACh na evolução tardia da sepse. No experimento agudo utilizamos camundongos Balb/c, induzimos sepse por CLP em diferentes gravidades (leve, moderado e grave), 6 horas após o CLP foi realizado teste comportamental SHIRPA e logo após os animais foram sacrificados. No experimento crônico os camundongos Balb/c foram submetidos ao CLP leve, o SHIRPA foi realizado 6 horas e 15 dias após o CLP e os animais foram sacrificados 15 dias após o CLP. No experimento dos efeitos da ACh utilizamos camundongos Balb/c que receberam a droga donepezila (5 mg/kg/dia, oralmente) sete dias antes do CLP leve até o dia do sacrifício e os camundongos homozigotos mutantes VAChT KD também submetidos ao CLP leve. O teste comportamental SHIRPA foi realizado 6 horas após o CLP e os animais sacríficos 15 dias após o CLP. O plasma, o baço e o hipocampo foram removidos em todos os experimentos. Os níveis do S100? foram medidos no plasma. Os baços foram pesados, e por citometria de fluxo foi caracterizado os linfócitos (linfócitos T citotóxicos, linfócitos T auxiliares, linfócitos B, células T reguladoras e células Th17) e morte celular (Apoptose inicial, necrose e apoptose tardia). Os níveis de citocinas no baço, hipocampo e plasma foram determinados por ELISA. Nossos resultados mostram que no experimento agudo, 6 horas após o CLP a encefalopatia é diferente dependendo da gravidade da sepse, e o perfil de linfócitos no baço não é alterado por nenhuma gravidade da sepse. No entanto, a ativação de células do baço foi indicada no nosso estudo por variações na quantidade de citocinas no baço. No experimento crônico observamos que 15 dias após o CLP os animais apresentam encefalopatia séptica, e esta está correlacionada com a diferenciação e morte celular de linfócitos do baço, o que leva a um alto perfil imunossupressor. No experimento da ACh mostramos que a estimulação da transmissão colinérgica, utilizando donepezila, diminui a inflamação, por aumentar linfócitos, morte linfocitária e diminuir citocinas pró-inflamatória. E, ao contrário, a diminuição da transmissão colinérgica, experimento VAChT KD, observouse uma diminuição de linfócitos, sem morte celular e aumento da inflamação. Desta forma, concluímos que a alteração neurológica nos animais com sepse está associada com as alterações imunológicas tardias e que a ACh tem um importante papel no perfil imunológico 15 dias após o CLP / Sepsis is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses to infection. One of the main components of the host response in septic shock are the reciprocal interactions between the immune system and the central nervous system, so the aim of this study was to investigate the development of neurological disorders and their association with immunological changes in early and late stages after sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). We divided in three experiments: acute, chronic and chronic ACh. In acute experiment we use Balb/c mice, induce sepsis by CLP in different severities (mild, moderate and severe), 6 hours after CLP was conducted behavioral test SHIRPA and after the animals were sacrificed. In the chronic experiment Balb/c mice were subjected to CLP mild, the SHIRPA was performed 6 hours and 15 days after CLP, and animals were sacrificed 15 days after CLP. In chronic ACh experiment use Balb/c mice that received the drug Donepezil (5 mg/kg/day, orally) seven days before the CLP mild until the day of sacrifice and use too mice homozygous mutants KD VAChT also submitted to CLP mild. The SHIRPA behavioral test was performed 6 hours after CLP and the animals were sacrificed 15 days after CLP. The plasma, spleen and hippocampus were removed in all experiments. The levels of S100? were measured in plasma. The spleens were weighed, and flow cytometry was characterized lymphocytes (cytotoxic T lymphocytes, helper T lymphocytes, B lymphocytes, regulatory T cells and Th17 cells) and cell death (apoptosis initial, necrosis and DNA fragmentation). Cytokine levels in the spleen, hippocampus and plasma were determined by ELISA. Our results show that in the acute experiment, 6 hours after CLP encephalopathy is different depending on the severity of sepsis, since the profile of the spleen lymphocytes is not changed by any severity of sepsis. However, the spleen cell activation was shown in this study by variations in the quantity of cytokines in the spleen. In the chronic experiment we observed that 15 days after CLP animals have septic encephalopathy, and this correlates with cell differentiation and the death of spleen lymphocytes, which leads to a high immunosuppressive profile. Since in the chronic ACh experiment have shown that stimulation of cholinergic transmission, using donepezil, reduces inflammation by increasing lymphocytes, lymphocyte death and decreasing proinflammatory cytokine. And, conversely, the reduction in cholinergic transmission, KD VAChT experiment, we observed a decrease of lymphocytes, and increase cell death without inflammation. Thus, we conclude that the neurological deficits in animals with sepsis is associated with immunological late changes and ACh plays an important role in the immune profile 15 days after CLP

O infarto do miocárdio (IM), uma das principais causas de morte nas sociedades industrializadas, é sempre acompanhado por uma notável alteração da modulação autonômica, caracterizada por hiperatividade simpática e diminuição do tono parassimpático ao coração. O bloqueio da atuação do simpático cardíaco tem sido amplamente utilizado como estratégia terapêutica eficaz para redução da morbi-mortalidade em pacientes com IM. Entretanto, há evidências de que o restabelecimento da função parassimpática ao coração pode ser igualmente benéfica, uma vez que a diminuição do parassimpático cardíaco é um fator de risco independente de morte súbita. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da inibição da acetilconinesterase plasmática (AChE), por meio da administração endovenosa do brometo de piridostigmina (PIR), sobre o eletrocardiograma (ECG), hemodinâmica e modulação autonômica apos o IM agudo em ratos. Ratos foram anestesiados com uretana e mantidos a uma temperatura de 36-37 ºC. Tiveram eletrodos subcutâneos para registro do ECG implantados, e a artéria e veia femoral cateterizadas para medida direta de PA e administração de drogas, respectivamente. Experimentos preliminares foram realizados para determinação de uma dose de PIR que não causasse grande repercussão hemodinâmica. A atividade da acetilcolinesterase plasmática, bem como o tono autonômico cardíaco também foram avaliados em ratos normais. Em outro protocolo, ratos anestesiados, sob registro contínuo do ECG e PA, tiveram o ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda ligado para provocar um extenso IM e, após 10 min, foram tratados com PIR (0,25 mg/kg, i.v) ou salina (solução fisiológica 0,9%), e os registros foram acompanhados por 4 h. Ratos controles tiveram o tórax aberto, mas a artéria coronária foi mantida intacta. Ao final, os ratos tiveram o coração retirado para avaliação da extensão da isquemia miocárdica e para o estudo da conexina 43. A administração endovenosa de PIR foi efetiva em reduzir a atividade da AChE e provocou uma discreta redução da FC (438±8 para 387±10 bpm), sem alteração da PA. Ratos tratados com PIR tiveram menor tono simpático e maior tono vagal cardíaco que os ratos que receberam salina. O tratamento com PIR diminuiu a incidência de arritmias nos animais com IM e aumentou a porcentagem de ratos que sobreviveram até a 4ª hora após o infarto (72 vs 58% nos não tratados). A PIR também preveniu o aumento do intervalo QTc, observado após o IM em ratos não tratados (=-2±4, vs 33±13 ms). A quantidade de conexina 43 foi marcadamente reduzida pelo IM em ratos não tratados (0,7±0,1 vs 2,2±0,4 ua), redução esta que não ocorreu nos ratos com IM tratados com PIR (1,3±0,3 ua). Por fim, foi realizado um ensaio, in vitro, em cardiomiócitos da linhagem H9c2 em cultura, e foi observado que a PIR preveniu a degradação da Cx43 induzida por meio isquêmico durante 4 horas. Portanto, a administração aguda de PIR provocou uma bradicardia pouco intensa, sem repercussões hemodinâmicas importantes, aumentou o tono vagal cardíaco, preveniu o prolongamento do intervalo QTc, diminuiu a incidência de arritmias, e preveniu a degradação da Cx43 nos corações dos ratos infartados. / Myocardial infarction (MI), a leading cause of death in industrialized societies, is always accompanied by a remarkable change in cardiovascular autonomic modulation, characterized by sympathetic overactivity and decreased vagal tone to the heart. The blockade of the cardiac sympathetic activity has been widely used as an effective therapeutic strategy to reduce morbidity and mortality in patients with MI. However, there is evidence that improvement of parasympathetic function can also be beneficial since reduction of cardiac vagal function is an independent risk factor for sudden death. The aim of this study was to evaluate the influence of inhibition of plasma acetilconinesterase (AChE), by intravenous administration of pyridostigmine bromide (PYR) on the electrocardiogram (ECG), hemodynamics and cardiovascular autonomic modulation shortly after MI in rats. Rats were anesthetized with urethane and maintained on a heating pad. Subcutaneous electrodes to record the ECG were installed and catheters were inserted into femoral artery and vein for measurement of blood pressure and drug administration, respectively. Preliminary experiments were performed to determine a dose of PYR that would not cause major hemodynamic consequences. Plasma AChE activity, and cardiac autonomic tone were also evaluated in normal rats. Then, anesthetized rats under continuous recording of ECG and BP, had the anterior descending branch of the left coronary artery ligated to elicit extensive MI and, after 10 min, were treated with PYR (0.25 mg/kg, iv) or saline (0.9% NaCl) and monitored for the next 4 h. Control rats had the chest open, but coronary artery was kept intact. At the end, the rats had the heart removed to determine the size of myocardial isquemia and to study connexin 43. Intravenous administration of PYR was effective in reducing AChE activity of and caused a mild reduction in HR (438±8 to 387±10 bpm) with no change in BP. Also, rats treated with PYR had lower sympathetic and higher cardiac vagal tone as compared to untreated rats. The treatment with PYR decreased the incidence of arrhythmias after MI and increased the percentage of rats that survived until the 4th hour after infarction (72 vs 58 % in untreated). PYR also prevented the increase in QTc interval observed after MI in untreated rats (=-2±4 vs 33±13 ms). The amount of connexin 43 was markedly reduced by MI in untreated rats (2.24±0.46 vs 0.72±0.14 au), nevertheless, this reduction was not observed in infarcted rats that received PYR (1.31±0.29 au). Finally, an in vitro assay was performed on the line H9c2 cardiomyocytes in culture, and it was observed that PYR prevented the degradation of Cx43 induced by ischemic medium for 4 hours. Therefore, the acute administration of PYR caused mild bradycardia without hemodynamic repercussions, increased vagal tone, prevented the prolongation of the QTc interval and decreased the incidence of arrhythmias and prevented the degradation of Cx43 in infarcted rat hearts.

Sabendo-se que o sistema colinérgico muscarínico modula funções cognitivas, propomos estudar as toxinas muscarínicas isoladas do veneno da M. lemniscatus, MT-Mlα e MT-Mlβ, sobre o processo de aprendizado e memória. Ratos Wistar machos foram injetados por via intrahipocampal com MT-Mlα, MT-Mlβ ou solução de Ringer (SRg). Após um período de sete dias de treino no Labirinto Aquático de Morris (LAM), os ratos receberam uma das toxinas ou SRg (dia da inoculação) e 20 min e 24 h após a inoculação foram testados no LAM. A MT-Mlα reduziu o tempo de permanência no quadrante do dia anterior, indicando interferência na evocação da memória. Por outro lado, a MT-Mlβ causou um efeito facilitatório quanto à recuperação da localização da plataforma. A ansiedade foi avaliada no Labirinto em Cruz Elevado, o treino foi feito após 30 min da injeção e o teste 24 h após. O tratamento com a MT-Mlβ mostrou ter um efeito ansiogênico, o que pode ter contribuído para o efeito facilitatório sobre a memória, pois sabe-se que a ansiedade até certo nível, pode favorecer o desempenho cognitivo. / Knowing that the muscarinic cholinergic system modulates cognitive functions, we propose to study the muscarinic toxins isolated from the venom of M. lemniscatus, MT-Mlα and MT-Mlβ, on the process of learning and memory. Male Wistar rats were injected by intrahippocampal pathway with MT-Mlα, MT-Mlβ or Ringer\'s solution (SRG). After a period of seven days training in Morris Water Maze (MWM), rats received a toxin or SRG (Inoculation day) and 20 min and 24 h after inoculation were tested in LAM. The MT-Mlα reduced the time spent in the quadrant of the previous day, indicating interference in the evocation of memory. On the other hand, the MT-Mlβ caused a facilitatory effect in recovering the location of the plataform. Anxiety was assessed in the Elevated Plus Maze, the training was done at 30 min after injection and 24 h after the test. Treatment with MT-Mlβ shown to have an anxiogenic effect, which may have contributed to the facilitatory effect on memory, since it is known that anxiety to a certain level can help cognitive performance.

A sepse é caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró- e anti-inflamatória às infecções. Um dos principais componentes da resposta do hospedeiro no choque séptico são as interações recíprocas entre o sistema imune e o sistema nervoso central, desta forma o objetivo deste estudo foi investigar o desenvolvimento de alterações neurológicas e sua associação com alterações imunológicas em fases iniciais e tardias após a sepse por ligação e perfuração cecal (CLP). Dividimos em três experimentos: agudo, crônico e efeito da ACh na evolução tardia da sepse. No experimento agudo utilizamos camundongos Balb/c, induzimos sepse por CLP em diferentes gravidades (leve, moderado e grave), 6 horas após o CLP foi realizado teste comportamental SHIRPA e logo após os animais foram sacrificados. No experimento crônico os camundongos Balb/c foram submetidos ao CLP leve, o SHIRPA foi realizado 6 horas e 15 dias após o CLP e os animais foram sacrificados 15 dias após o CLP. No experimento dos efeitos da ACh utilizamos camundongos Balb/c que receberam a droga donepezila (5 mg/kg/dia, oralmente) sete dias antes do CLP leve até o dia do sacrifício e os camundongos homozigotos mutantes VAChT KD também submetidos ao CLP leve. O teste comportamental SHIRPA foi realizado 6 horas após o CLP e os animais sacríficos 15 dias após o CLP. O plasma, o baço e o hipocampo foram removidos em todos os experimentos. Os níveis do S100? foram medidos no plasma. Os baços foram pesados, e por citometria de fluxo foi caracterizado os linfócitos (linfócitos T citotóxicos, linfócitos T auxiliares, linfócitos B, células T reguladoras e células Th17) e morte celular (Apoptose inicial, necrose e apoptose tardia). Os níveis de citocinas no baço, hipocampo e plasma foram determinados por ELISA. Nossos resultados mostram que no experimento agudo, 6 horas após o CLP a encefalopatia é diferente dependendo da gravidade da sepse, e o perfil de linfócitos no baço não é alterado por nenhuma gravidade da sepse. No entanto, a ativação de células do baço foi indicada no nosso estudo por variações na quantidade de citocinas no baço. No experimento crônico observamos que 15 dias após o CLP os animais apresentam encefalopatia séptica, e esta está correlacionada com a diferenciação e morte celular de linfócitos do baço, o que leva a um alto perfil imunossupressor. No experimento da ACh mostramos que a estimulação da transmissão colinérgica, utilizando donepezila, diminui a inflamação, por aumentar linfócitos, morte linfocitária e diminuir citocinas pró-inflamatória. E, ao contrário, a diminuição da transmissão colinérgica, experimento VAChT KD, observouse uma diminuição de linfócitos, sem morte celular e aumento da inflamação. Desta forma, concluímos que a alteração neurológica nos animais com sepse está associada com as alterações imunológicas tardias e que a ACh tem um importante papel no perfil imunológico 15 dias após o CLP / Sepsis is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses to infection. One of the main components of the host response in septic shock are the reciprocal interactions between the immune system and the central nervous system, so the aim of this study was to investigate the development of neurological disorders and their association with immunological changes in early and late stages after sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). We divided in three experiments: acute, chronic and chronic ACh. In acute experiment we use Balb/c mice, induce sepsis by CLP in different severities (mild, moderate and severe), 6 hours after CLP was conducted behavioral test SHIRPA and after the animals were sacrificed. In the chronic experiment Balb/c mice were subjected to CLP mild, the SHIRPA was performed 6 hours and 15 days after CLP, and animals were sacrificed 15 days after CLP. In chronic ACh experiment use Balb/c mice that received the drug Donepezil (5 mg/kg/day, orally) seven days before the CLP mild until the day of sacrifice and use too mice homozygous mutants KD VAChT also submitted to CLP mild. The SHIRPA behavioral test was performed 6 hours after CLP and the animals were sacrificed 15 days after CLP. The plasma, spleen and hippocampus were removed in all experiments. The levels of S100? were measured in plasma. The spleens were weighed, and flow cytometry was characterized lymphocytes (cytotoxic T lymphocytes, helper T lymphocytes, B lymphocytes, regulatory T cells and Th17 cells) and cell death (apoptosis initial, necrosis and DNA fragmentation). Cytokine levels in the spleen, hippocampus and plasma were determined by ELISA. Our results show that in the acute experiment, 6 hours after CLP encephalopathy is different depending on the severity of sepsis, since the profile of the spleen lymphocytes is not changed by any severity of sepsis. However, the spleen cell activation was shown in this study by variations in the quantity of cytokines in the spleen. In the chronic experiment we observed that 15 days after CLP animals have septic encephalopathy, and this correlates with cell differentiation and the death of spleen lymphocytes, which leads to a high immunosuppressive profile. Since in the chronic ACh experiment have shown that stimulation of cholinergic transmission, using donepezil, reduces inflammation by increasing lymphocytes, lymphocyte death and decreasing proinflammatory cytokine. And, conversely, the reduction in cholinergic transmission, KD VAChT experiment, we observed a decrease of lymphocytes, and increase cell death without inflammation. Thus, we conclude that the neurological deficits in animals with sepsis is associated with immunological late changes and ACh plays an important role in the immune profile 15 days after CLP

A farmacodependência é considerada uma doença crônica e sujeita à recaídas, na qual o indivíduo perde o controle sob a utilização de determinada droga de abuso. Conforme o usuário persiste com o uso da droga, ocorrem alterações anatômicas, fisiológicas e neuroquímicas no sistema nervoso central (SNC), as quais podem culminar no desenvolvimento de um comportamento compulsivo. A neurobiologia deste processo é complexa e envolve mecanismos de plasticidade em diferentes sistemas neurotransmissores. O principal deles é o sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, constituído por neurônios da área ventral do tegmento mesencefálico (VTA) que se projetam para o núcleo accumbens (NAc) e ao córtex pré-frontal (CPF), diretamente relacionado aos processos motivação e recompensa. Contudo, o mesmo não é suficiente para elucidar a complexidade da doença, o que levou ao entendimento da presença de outros sistemas neurotransmissores neste processo. Sabe-se que o sistema colinérgico muscarínico está diretamente envolvido em diferentes doenças neuropsiquiátricas, incluindo a farmacodependência. Além disso, os receptores colinérgicos muscarínicos (mAChRs) estão densamente presentes em regiões límbicas, onde acetilcolina e dopamina interagem por neuromodulação. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi investigar as possíveis alterações plásticas no sistema colinérgico muscarínico resultantes de tratamentos com cocaína que mimetizaram o consumo compulsivo humano. Para tanto, foram realizados ensaios comportamentais com camundongos Swiss machos adultos em campo aberto, tratados durante um (acute binge paradigm, 30 mg/kg) ou 14 dias (escalating dose binge paradigm, 15 - 30 mg/kg) com cocaína. Os animais receberam 3 injeções intraperitoneais (i.p.) de cocaína com intervalos de 60 minutos, durante os quais a atividade locomotora foi avaliada. Após a análise comportamental, os animais foram eutanasiados por decapitação para a remoção do encéfalo e dissecação do estriado, CPF e hipocampo, regiões cerebrais cruciais para o processo fisiopatológico da farmacodependência. Componentes do sistema dopaminérgico (receptores D1 e D2) e colinérgico muscarínico (M1-M5 mAChRs, ChAT, VAChT e AChE) foram avaliados por Immunoblotting. O sangue dos animais foi coletado para a realização das dosagens de cocaína e benzoeilecgonidina por UPLC-MS/MS. O desempenho locomotor total dos animais tratados com cocaína foi superior ao dos animais controle. O grupo tratado com escalonamento de dose desenvolveu sensibilização comportamental aos efeitos psicoestimulantes da cocaína no segundo dia de tratamento e, a partir dele, a atividade locomotora total manteve a mesma magnitude. Além disso, conforme o aumento da dose, os animais mantiveram um nível de atividade superior ao basal, mesmo após o término do experimento. As análises de Immunoblotting mostraram alterações dopaminérgicas e colinérgicas. No estriado observou-se redução da densidade de D2R após o tratamento de 14 dias e aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. Já no hipocampo observou-se redução de D1R e aumento de D2R, M1 e M5 mAChR após o tratamento crônico; e um aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. No CPF, foi evidenciada redução de M3 e de M5 mAChR após o tratamento cônico de 14 dias. Em relação às moléculas colinérgicas, observou-se, após o tratamento crônico, aumento da quantidade de ChAT em todas as estruturas estudadas. Além disso, VAChT mostrou-se aumentado no hipocampo após ambos os tratamentos. As dosagens plasmáticas revelaram a presença de 20,38 ± 3,4 ng/mL de cocaína e 224,6 ± 24,02 ng/mL de benzoilcgonina (BZE) nos animais do grupo agudo e, nos do grupo crônico, 62,26 ± 10,56 ng/mL e 375,1 ± 25,62 ng/mL de cocaína e BZE respectivamente. / Drug addiction is a chronic releapsing disorder characterized by the loss of control in limiting drug intake. As the drug use persists, anatomical, physiological and neurochemical changes occur in the central nervous system (CNS), which may lead to the development of compulsive behaviors. The neurobiology of this process is complex and involves mechanisms of plasticity in different neurotransmitter systems. The main one is the mesocorticolimbic dopaminergic system, composed by neurons from the ventral tegmental area (VTA) that projects to the nucleus accumbens (NAc), which is directly related to motivation and reward processes. However, just dopamine is not enough to elucidate the complexity of the disease, leading to the comprehension of another neurotransmitters system involved. It is known that the cholinergic system is involved in different neuropsychiatric disorders, including drug addiction. Furthermore, cholinergic muscarinic receptors (mAChRs) are densely present in limbic regions, where acetylcholine and dopamine interact by neuromodulation. Considering that, the aim of this study was to evaluate the existence of neuroadaptative changes in the cholinergic muscarinic system induced by cocaine in a compulsive-like behavior model in mice. Swiss-Webster adult male mice received 3 daily injections (i.p) of cocaine or saline, with a 60-min interval among them, either acutely (acute binge paradigm) or for 14 consecutive days (escalating dose binge paradigm). The locomotor activity was monitored in the open field during 60 min, in 5 min bins, after each injection. After behavioral analysis animals were euthanized by decapitation and the brain regions of striatum, hippocampus and prefrontal cortex, involved in the pathophysiology of addiction were dissected. Dopaminergic receptors (D1R and D2R), cholinergic muscarinic receptors (M1-M5 mAChRs), choline acetylytransferase (ChAT), acetylcholine vesicular transporter and acetylcholinesterase (AChE) were quantified by Immunoblotting. Blood samples were collected with heparin and plasma was separated and stored with 2% sodium fluorite at -80ºC for cocaine and benzoilecgonine quantification by UPLC-MS/MS. In the open field, animals treated with cocaine showed an increase in locomotor activity compared to control. Cocaine induced behavioral sensitization, in the escalating dose group on day 2, and after that the locomotor activity had the same magnitude until day 14th. These animals also kept the locomotor activity elevated even after the last injection. Immunobltting shows dopaminergic and cholinergic changes. An increase in M3 was observed in both hippocampus and striatum of animals acutely treated. After 14 days, there was an increase in M1, M5 and D2 and a decrease in D1 in hippocampus. There was also a decrease in D2 in the striatum; and finally, there was a decrease in M5 and M3 in the prefrontal cortex. ChAT densities were higher in all regions after the chronic treatment. Besides that, VAChT were higher in the hippocampus after both acute and chronic treatments. UPLC-MS/MS for cocaine and benzoilecgonine demonstrated the presence of 20,38 ± 3,4 ng/mL of cocaine and 224,6 ± 24,02 ng/mL of BZE in the acute binge group; and, 62,26 ± 10,56 ng/mL and 375,1 ± 25,62 ng/mL of cocaine and BZE, respectively in the escalating dose animals.

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-11-16T13:07:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Efeitos do Riluzole no Sistema Nervoso Central e Periférico de vertebrados..pdf: 3331266 bytes, checksum: 695a072e1aef84e61ff2e6ef010514a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-16T13:07:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Efeitos do Riluzole no Sistema Nervoso Central e Periférico de vertebrados..pdf: 3331266 bytes, checksum: 695a072e1aef84e61ff2e6ef010514a2 (MD5) Previous issue date: 2014-05-15 / O Riluzole é quimicamente relacionado aos benzotiazóis e é conhecido como um agente neuroprotetor, possuindo propriedades anticonvulsivantes, analgésicas, anestésicas, e sedativas. A ação neuroprotetora mais conhecida desta droga ocorre através da inibição da transmissão glutamatérgica no sistema nervoso central (SNC). Nesse trabalho, o Riluzole foi ensaiado sobre a junção neuromuscular esquelética (JNM) de aves visando estudar sua interação com o sistema nervoso periférico (SNP). Também foi verificada a ação do Riluzole em fatias de hipocampo de camundongos, comparando os resultados com agentes antiinflamatórios como o extrato de Hypericum brasiliense (HBE) e seu principal composto, quercetina, frente ao veneno de serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt). No SNP, o Riluzole foi ensaiado em preparação músculo biventer cervicis de pintainhos, em banho de órgão isolado, nas doses de 5, 10 e 20 µM. Foram obtidos registros da amplitude da força de contração muscular em presença ou ausência de Riluzole durante 120min, e as curvasresposta à adição exógena de acetilcolina (ACh – 110 µM) e ao cloreto de potássio (KCl – 20 mM), antes e após a incubação com o tratamento. O Riluzole induziu respostas tempo e dosedependentes. Na concentração de 5 µM houve uma diminuição gradativa e significativa da resposta contrátil (p<0.05). Na concentração de 10 µM, houve uma facilitação significativa (p<0.05) da resposta contrátil e das curvas evocadas pelo KCl e ACh. No entanto, na dose de 20 µM houve uma estabilização da contratilidade em relação ao controle. Em todas as doses de Riluzole ensaiadas na JNM houve um aumento significativo da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE). Na sequência da verificação do mecanismo de ação do Riluzole sobre a placa motora, registros eletromiograficos foram tomados na presença dos inibidores especificos, Neostigmina e d-Tubocurarina, onde foi observada uma reversão dos efeitos quando Riluzole foi adicionado ao meio. Como modelo celular de SNC, a ação do Riluzole foi ensaiada em fatias de hipocampo e a viabilidade destas frente ao veneno de Cdt foi observada por meio da atividade de desidrogenases mitocondriais. Tanto Riluzole, como o extrato da planta HBE e quercetina, aumentaram a viabilidade celular em 1h de incubação a 37˚C na presença do veneno. Quercetina foi mais efetiva do que Riluzole e HBE em neutralizar a lise celular induzida pelo veneno. Assim, estes resultados demonstram a influência do Riluzole no SNC como neuroprotetor de toxinas de veneno de serpente, possivelmente atuando como agente anti-inflamatório, e no SNP, aumentando a atividade da AChE e atuando de maneira dose-dependente sobre a placa motora. / Riluzole is chemically related to benzothiazoles and it is known as a neuroprotective agent with anticonvulsant, analgesic, anesthetic and sedative properties. The neuroprotective drug action is well established being through inhibition of glutamatergic transmission in the central nervous system (CNS). In this study, we have assayed the drug Riluzole at skeletal neuromuscular junction (NMJ) of avian, seeking its interaction with the peripheral nervous system (PNS). We also tested Riluzole in the CNS of mice by comparing its results with anti - inflammatory agents, such as extract of Hypericum brasiliense (HBE) and its main isolated compound, quercetin, against the poison of Crotalus durissus terrificus (Cdt). In the PNS, Riluzole was tested in nerve-muscle preparations in chick biventer cervicis at doses of 5, 10 and 20 μM. It was obtained recordings of the muscle twitch-tension amplitude and the contracture responses to exogenous applied acetylcholine (ACh 110 μM) and potassium chloride (KCl – 20 mM) in the presence or absence of Riluzole during 120 min. Riluzole induced time and dose-dependent responses. At concentration of 5μM there was a gradual and significant decrease in the contractile response (p<0.05). The concentration of 10μM showed a significant facilitation of the contractile response (p<0.05) and an increase in the curve responses evoked by KCl and ACh. However, at a dose of 20 μM there was a stabilization of contractility compared to control. All tested doses of Riluzole showed a significant increase in the activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE). The action mechanism of Riluzole on the endplate was further analysed through the use of specific inhibitors, Neostigmine and dTubocurarine, a reversal of effects those was seen when Riluzole was added to the medium. As a cellular model of CNS, the action of Riluzole was tested in mice hippocampal slices. The cell viability against Cdt venom was observed through the activity of mitochondrial dehydrogenases. Riluzole as much as the plant extract HBE and its active ingredient, quercetin, increased cell viability in 1h incubation at 37˚C in the presence of the poison. However, quercetin showed to be more effective than Riluzole and HBE in neutralizing cell lysis induced by the venom. Thus, these results demonstrate the influence of Riluzole on the CNS, it showed a neuroprotective effect against snake venom toxins, possibly acting as an anti-inflammatory agent. As for the cholinergic system in the NMJ, Riluzole showed an interesting effect by increasing the activity of AChE and by acting in a dose-dependent manner over the endplate.

A destruição crônica do aparelho de inserção periodontal devido a uma intensa resposta inflamatória a bactérias conduz a uma condição clínica conhecida como doença periodontal. A inflamação periodontal geralmente provoca úlceras superficiais no sulco gengival, onde os capilares sanguíneos estão expostos a bactérias. Patógenos periodontais, assim como seus produtos podem ser translocados e liberados do sulco gengival para a corrente sanguínea e, portanto, ter efeitos periféricos. A bolsa periodontal é também importante reservatório de mediadores inflamatórios que podem atingir a corrente sanguínea. Diversos estudos avaliam a relação entre a doença periodontal e as doenças cardiovasculares. Sabe-se que muitas doenças cardiovasculares têm início em desordens vasculares, principalmente na camada endotelial dos vasos sanguíneos de grande condutância. Assim, o foco deste estudo foi investigar a reatividade vascular de aortas de animais com periodontite. Tanto a contração para a norepinefrina quanto o relaxamento para a acetilcolina estão diminuídos em animais com periodontite, mas os mecanismos para estes efeitos são diferentes. A diminuição da resposta contrátil à norepinefrina parece estar associada a um aumento da produção de óxido nítrico através da isoforma induzível da óxido nítrico sintase e a diminuição da resposta relaxante à acetilcolina parece estar associada a produção de prostanóides principalmente derivados da isoforma do tipo II da enzima ciclooxigenase. / The chronic destruction of the periodontal attachment apparatus due to an intense inflammatory response to bacteria leads to a condition known as periodontal disease. The periodontal inflammation usually causes superficial ulcers in the gingival sulcus, where blood capillaries are exposed to bacteria. Periodontal pathogens, as well as their products can be translocated and released into the gingival sulcus, subsequently into the bloodstream and thus have peripheral effects. The periodontal pocket is also an important reservoir of inflammatory mediators that can reach the bloodstream. Several studies have evaluated the relationship between periodontal disease and cardiovascular disease. It is known that many cardiac diseases begin as vascular disorders, especially in the endothelial layer of blood vessels of large conductance. Thus, the focus of this study was to investigate the vascular reactivity of aortas from animals with periodontitis. Both norepinephrine-mediated contraction and acetylcholine-mediated relaxation are decreased in animals with periodontitis, but the mechanisms are different for these responsess. The contraction appears to be associated with increased production of nitric oxide by inducible isoform of nitric oxide synthase and relaxation with prostanoids primarily derived type II isoform of the enzyme cyclooxygenase.