Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) são rRNA N-glicosilases capazes de inibir a síntese protéica pela remoção de uma adenina específica do RNA ribossomal. São geralmente classificadas em tipo 1 e tipo 2, sendo as últimas divididas em altamente tóxicas e não tóxicas. A maior parte das RIPs tipo 2 identificadas pertence a espécies de dicotiledôneas, como é o caso da pulchellina. As cadeias tóxicas das RIPs possuem uma região C-terminal hidrofóbica conservada, a qual se atribui a capacidade de interação com a membrana do retículo endoplasmático (RE), durante o transporte retrógrado da toxina para o citosol. Neste trabalho duas abordagens diferentes foram aplicadas para o estudo das RIPs tipo 2: identificação e caracterização de novos integrantes desta família de proteínas, e investigação da interação da cadeia-A da pulchellina (PAC) com sistemas miméticos da membrana celular. Na primeira abordagem, uma busca in silico em bancos de dados genéticos públicos permitiu identificar quatro novas RIPs do tipo 2 de monocotiledôneas. A análise da estrutura primária das proteínas identificadas mostrou a ocorrência de mutações em alguns dos principais aminoácidos que formam o sítio ativo nas RIPs, indicando uma possível perda de função. O representante de Saccharum officinarum (cana-de-açúcar) foi então analisado em maior detalhe, sendo sua cadeia-A clonada (soRIPA), expressa em sistema heterólogo e caracterizada em termos de atividade e estrutura secundária. Os ensaios in vitro mostraram que a soRIPA não foi capaz de depurinar ribossomos eucariotos. Porém, os ensaios de inibição da síntese proteica mostraram uma possível atividade inibitória da soRIP, que precisa ainda ser confirmada. A presença dos transcritos no banco do SUCEST sugere que estes genes não sejam pseudogenes, embora não tenha sido possível purificar a proteína a partir de extratos de folhas. Isto indica que se a soRIP está sendo traduzida, deve sofrer um rápido turnover, tornando difícil a sua detecção e purificação ou, ainda, que a ausência de sítios de ligação à galactose funcionais na cadeia-B impediu sua purificação por cromatografia de afinidade à galactose. A outra abordagem no estudo das RIPs tipo 2 foi centrada na cadeia-A recombinante da pulchellina (rPAC), estudando sua interação com monocamadas de Langmuir. Foram construídos 3 mutantes da rPAC, cada um com diferentes deleções na região C-terminal visando determinar a região responsável pela interação com a membrana do RE. A cinética de adsorção e pressão superficial exercida pela rPAC sobre a monocamada, assim como o estudo com os mutantes demontraram que a proteína interage fortemente com a monocamada fosfolipídica e que esta interação in vitro é dependente da presença da região C-terminal. De forma geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram com novas informações sobre esta família de proteínas, identificando e analisando novos integrantes e, ainda, adicionando detalhes do mecanismo funcional do tráfego das toxinas RIPs. / Ribosome Inactivating Proteins (RIPs) are rRNA N-glycosilases which are able to inhibit the protein synthesis by removing a specific adenine from the ribosomal RNA. They are usually classified as type 1 and type 2, being the latter divided into highly toxic and nontoxic. The majority of type 2 RIPs currently identified are found in species of dicotyledons, as the pulchellin. The toxic chain of RIPs has a conserved hydrophobic C-terminal region, which is believed to be responsible for the interaction with the lipid membrane of the endoplasmic reticulum ER during the retrograde transport of the toxin to the cytosol. In this work, two different approaches were applied in the study of type 2 RIPs: identification and characterization of new members of this protein family, and investigation of the interaction of the pulchellin\'s A-chain (PAC) with systems that mimic the cellular membrane. In the first approach, an in silico search in public genetic databases was performed and allowed us to identify four new type 2 RIPs in monocots. The primary structure analysis of the identified proteins showed the presence of mutations in key amino acids that form the active site of RIPs, indicating a possible interference on its catalytic activity. The representative of Saccharum officinarum (sugar cane) was then analyzed in greater detail. Its A-chain clone (soRIPA) was expressed in a heterologous system and characterized in terms of activity and secondary structure. In vitro experiments showed that soRIPA was not able to perform the depurination of eukaryotic ribosomes. However, the inhibition of protein synthesis assays presented a possible low inhibitory activity of the soRIP, which still needs to be further investigated. The presence of transcripts on the bank of SUCEST indicates that these genes are not pseudogenes, although it was not possible to purify the protein from leaf extracts. If the soRIP is being translated, this may indicate that it undergoes a quick turnover, preventing its detection and purification. It is also possible that the absence of functional galactose binding sites in the B-chain has prevented its purification by galactose affinity chromatography. Our second approach to the study of type 2 RIPs was focused on the recombinant pulchellin A-chain (rPAC), by investigating its interaction with Langmuir monolayers. We have constructed three mutants of rPAC, each one with different deletions at the C-terminal to determine the region responsible for interaction with the membrane of the ER. The adsorption kinetic and surface pressure applied by rPAC on the monolayer, as well as the study of the mutants, have demonstrated that the protein has a strong interaction with the phospholipid monolayer and that this interaction in vitro is dependent on the presence of the C-terminal. The results of this work have provided new information about the type 2 RIP protein family, identifying and analyzing new members, and also bringing new details about the functional mechanism of the RIP\'s toxin traffic.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-27052011-114447 |
| Date | 29 March 2011 |
| Creators | Luis Fernando Reyes |
| Contributors | Ana Paula Ulian de Araujo, Pietro Ciancaglini, Iran Malavazi, Ricardo De Marco, Renato de Azevedo Moreira |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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