A enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) catalisa a conversão de diidroorotato em orotato, a quarta e única reação redox da via metabólica da síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. DHODH tem sido explorada como alvo validado para terapias contra doenças proliferativas e parasitárias e, em particular, tem sido considerada um alvo atraente para o planejamento de fármacos com ação contra tripanossomatídeos, como parasitos dos gêneros Trypanosoma e Leishmania, que conjuntamente são responsáveis por doenças e mortes que acometem milhões de pessoas em todo o mundo. Neste trabalho, através da combinação de técnicas de DNA recombinante, termofluor, cristalografia de raios-X e ensaios de inibição in vitro e in silico, foi possível identificar sítios alvos na estrutura da DHODH para o desenvolvimento de ligantes, identificar inibidores potentes e seletivos contra as DHODHs de Leishmania major e Trypanosoma cruzi e, caracterizar seus mecanismos de inibição. Finalmente, o efeito leishmanicida observado em nossos ensaios anti-promastigota e os baixos níveis de citotoxicidade observados em células de mamíferos sugerem que alguns dos compostos identificados durante o desenvolvimento deste projeto como potentes inibidores da enzima DHODH poderão ser utilizados como protótipos para o desenvolvimento de fármacos com ação leishmanicida e tripanocida. Combinados, nossos resultados forneceram uma nova e importante contribuição para a compreensão do mecanismo de ação das enzimas DHODH da classe 1A e para o desenho de fármacos baseado nas estruturas das enzimas diidroorotato desidrogenase de Leishmania major e Trypanosoma cruzi. Além disso, a alta identidade sequencial e estrutural observada entre as enzimas de tripanossomatídeos sugerem que uma única estratégia para o desenho de inibidores baseado em estrutura poderá ser usada para explorar a enzima DHODH como alvo terapêutico para várias doenças negligenciadas tropicais como Leishmaniose, Doença do sono e Doença de Chagas / Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) catalyses the conversion of dihydroorote to orotate, the fourth step and only redox reaction in the de novo pyrimidine biosynthetic pathway. DHODH has been exploited as a validated target for therapy against proliferative and parasitic diseases, and in particular, has been considered to be an attractive target for drug development against trypanosomatids, such as parasites from the genera Leishmania and Trypanosoma that collectively cause disease and death in millions of humans. In this work, by combining recombinant DNA technology, thermofluor, X-ray crystallography and in vitro and in silico inhibition assays, we have been able to identify target sites for ligand design, identify potent and selective inhibitors against trypanosomatid DHODHs and fully characterize their mechanism of inibition. Finally, the anti-leishmanial effect observed in our anti-promastigote assays and the low citotoxicity levels observed against mammaliam cells strongly suggest that some of the compounds identified during the development of this project as potent DHODH inhibitors can be used as prototytes for the development of anti-leishmania and anti-trypanosoma drugs. Altogether, our findings provide a new and important contribution to the understanding of the mechanism of action of class 1A DHODHs and for the structure-assisted design of inhibitors against trypanosomatid DHODHs. Furthermore, the high sequence and structural similarity observed among trypanosomatid DHODH suggest that a single strategy of structure-based inhibitor design can be used to exploit DHODH as a druggable target against multiple neglected tropical diseases such as Leishmaniasis, Sleeping Sickness and Chagas\' Disease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-27062012-154855 |
| Date | 25 April 2012 |
| Creators | Matheus Pinto Pinheiro |
| Contributors | Maria Cristina Nonato Costa, Carlos Alberto Montanari, Richard Charles Garratt, Rafael Victório Carvalho Guido, Richard John Ward |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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