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Previous issue date: 2009-02-27 / Uma cisteína proteinase recombinante, rLdccys1, obtida pela expressão do gene Ldccys1 de Leishmania (Leishmania) chagasi em sistema bacteriano, foi utilizada em ensaios de imunodiagnóstico por ELISA e DTH em cães de uma região endêmica de leishmaniose visceral (LV), Teresina, Piauí. A rLdccys1 também foi utilizada para a imunização de cães e a avaliação da possível proteção dos animais imunizados contra o desafio com a L. (L.) chagasi. Os ensaios por ELISA dos soros de cães com LV mostraram que a sensibilidade para a detecção de anticorpos anti-L. (L.) chagasi utilizando a rLdccys1 e os extratos de promastigotas e amastigotas de L. (L.) chagasi foi de 98%, 86% e 89%, respectivamente. A rLdccys1 não apresentou reatividade cruzada com os soros de cães com doenças comuns nas regiões endêmicas de LV, tais como erliquiose, babesiose e doença de Chagas e a especificidade dos ensaios de ELISA utilizando-se a rLdccys1 e os extratos de amastigotas e promastigotas de L. (L.) chagasi foi de 96%, 69% e 68%, respectivamente. As respostas de DTH foram avaliadas nos cães após a injeção subcutânea da rLdccys1 ou do extrato dos amastigotas de L. (L.) chagasi. Todos os cães assintomáticos apresentaram resposta de DTH positiva à rLdccys1 com a formação de nódulos em torno de 10 mm 48 horas após a injeção do antígeno, enquanto que os cães sintomáticos não apresentaram reatividade significante à rLdccys1 nos ensaios de DTH. As respostas de DTH foram mais intensas quando se utilizou a rLdccys1 comparadas às observadas com o extrato dos parasitas. A análise histológica mostrou áreas de necrose e hemorragia nos nódulos induzidos pelo extrato dos parasitas e reação granulomatosa típica, com predomínio de células mononucleares, nos cortes dos nódulos induzidos pela rLdccys1. A análise dos dados obtidos nos ensaios de ELISA e DTH realizados com a rLdccys1 e os extratos de amastigotas de L. (L.) chagasi mostrou a correlação inversa entre as respostas humoral e celular no desencadeamento da LV canina. As respostas celulares induzidas nos cães pela rLdccys1 foram avaliadas após a imunização dos animais com o antígeno recombinante juntamente com a Propionibacterium acnes. Os linfócitos de sangue periférico dos cães imunizados com a rLdccys1 + P. acnes apresentaram significantes índices de estimulação quando reestimulados in vitro com a rLdccys1 ou o extrato dos amastigotas de L. (L.) chagasi. A dosagem de citocinas nos sobrenadantes dessas culturas mostrou a secreção de níveis significantes de IFN-γ, enquanto IL-10 não foi detectada. Nos experimentos em que cães foram imunizados com a rLdccys1 + P. acnes e desafiados com a injeção intraperitoneal de 1x104 amastigotas isolados de cão infectado com a L. (L.) chagasi 3 de 4 animais sobrevieram dez semanas após o desafio, enquanto que os animais controles que receberam PBS e a P. acnes morreram em no máximo 4 e 6 semanas, respectivamente, após o desafio. Nos cães imunizados com a rLdccys1 o número de amastigotas de L. (L.) chagasi foi significantemente reduzido no baço, fígado e medula óssea comparado ao observado nos controles. A dosagem sérica de IFN-γ nos animais imunizados com a rLdccys1 mostrou a secreção significante dessa linfocina, enquanto que níveis basais de IL-10 foram detectados. Todos os cães imunizados com a rLdccys1 e desafiados pela picada das fêmeas de Lutzomyia longipalpis sobreviveram até dezesseis semanas após o desafio e os animais controles injetados com PBS e P. acnes morreram sete e nove semanas, respectivamente, após o desafio. Os cães controles apresentaram número significante de amastigotas de L. (L.) chagasi no fígado e baço, porém nos animais imunizados com a rLdccys1 nenhum parasita foi observado. No grupo imunizado com a rLdccys1 houve aumento crescente dos níveis séricos de IFN-γ durante a imunização que atingiu um pico uma semana após o desafio, enquanto que e a concentração de IL-10 foi mantida em níveis basais. Os dados do presente trabalho mostraram o potencial da rLdccys1 de L. (L.) chagasi para o diagnóstico e a imunoprofilaxia da LV canina, abrindo perspectivas para a imunização dos cães em larga escala nas regiões endêmicas de LV e a avaliação do impacto da proteção conferida nos animais imunizados na incidência da doença. / A recombinant protein, rLdccys1, produced by expression of the gene encoding a 30 kDa cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) chagasi, was used to detect specific antibodies in serum by enzyme-linked immunosorbent assays and to test for reactivity in delayed-type hipersensitivity (DTH) responses of dogs from an endemic region of visceral leishmaniasis (VL), Teresina, Piauí State, Brazil. The recombinant protein was also used for immunization of dogs and evaluation of its possible protective role against L. (L.) chagasi infection. The sensitivity for detection of specific antibodies to L. (L.) chagasi using rLdccys1 and lysates from L. (L.) chagasi promastigotes and amastigotes was 96%, 68%, and 69%, respectively. No cross reactivity between rLdccys1 and Chagas disease was observed, and little reactivity was found with sera from dogs with babesiosis and ehrlichiosis. The specificity of ELISA assays using rLdccys1, lysates from L. (L.) chagasi promastigotes and amastigotes was 96%, 69%, and 68%, respectively. DTH responses were determined after subcutaneous injection of rLdccys1 or L. (L.) chagasi amastigote extract and the induration area was measured at 24, 48 and 72 h after injection. All asymptomatic dogs showed a positive intradermal response to rLdccys1 (10 mm) which peaked at 48 h, whereas no significant reactivity to the recombinant antigen was found in the symptomatic group. DTH responses to rLdccys1 were higher than those induced by amastigote extract. Histological analysis of the intradermal induration showed a predominance of necrotic and hemorrhagic areas in sections from asymptomatic dogs injected with L. (L.) chagasi amastigote extract, whereas a typical granulomatous reaction mediated by mononuclear cells was observed in sections from asymptomatic animals injected with rLdccys1. Data analysis from ELISA and DTH assays with rLdccys1 and L. (L.) chagasi amastigote extracts showed that humoral and cellular responses were inversely correlated during the development of canine VL. Cellular immune responses induced by the recombinant antigen were evaluated after immunization of dogs with rLdccys1 plus Propionibacterium acnes. Peripheral blood mononuclear cells isolated from rLdccys1-immunized dogs showed significant stimulation indexes after in vitro incubation with either rLdccy1 or L. (L.) chagasi amastigote extracts. Cytokine dosages in the supernatants from lymphocyte cultures showed significant levels of IFN-γ, whereas IL-10 was not detected. Whereas 3 from 4 dogs immunized with rLdccys1 plus P. acnes and challenged by intraperitoneal injection of 1x104 L. (L.) chagasi amastigotes survived ten weeks after challenge, control dogs which received either PBS or P. acnes died after four and six weeks, respectively. The load of L. (L.) chagasi amastigotes in spleen, liver, and bone marrow from rLdccys1-immunized dogs was significantly reduced in comparison to that of non immunized controls. A significant concentration of IFN-γ and basal levels of IL-10 were detected in sera from dogs immunized with rLdccys1. All dogs immunized with rLdccys1 plus P. acnes and challenged by the bite of L. (L.) chagas infected Lutzomyia longipalpis survived until sixteen weeks after challenge, whereas control dogs injected with PBS or P. acnes died after seven and nine weeks, respectively. Control dogs showed a significant number of L. (L.) chagasi amastigotes in liver and spleen, but no parasites were found in rLdccys1- immunized dogs. During immunization with rLdccys1 there was an increase of serum levels of IFN-γ in the immunized dogs that peaked one week after challenge. In contrast, a very low concentration of IL-10 was detected in these animals. Overall, these findings indicate that L. (L.) chagasi recombinant cysteine proteinase is potentially useful for diagnosis and immunoprophylaxis of canine VL. We believe that results obtained open perspectives for immunization of dogs in the field and evaluation of the impact on the disease incidence. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/8809 |
| Date | 27 February 2009 |
| Creators | Pinheiro, Paulo Henrique da Costa [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Barbiéri, Clara Lúcia [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 112 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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