Leptospirose é uma doença infecciosa emergente cujos agentes etiológicos são espécies patogênicas do gênero Leptospira. Leptospiras patogênicas possuem inúmeros genes específicos codificando proteínas com funções desconhecidas, sugerindo que as leptospiras apresentam fatores de virulência únicos. Adesinas bacterianas são importantes fatores de virulência e, assim, a identificação de adesinas conservadas em espécies patogênicas de Leptospira pela construção de bibliotecas genômicas expostas na superfície de bacteriófagos (shotgun phage display), seguida por seleção em células e/ou componentes da matriz extracelular (biopanning), pode revelar novos antígenos e alvos para o tratamento e prevenção da leptospirose. Bibliotecas foram construídas com o DNA genômico de L. interrogans fragmentado e o fagomídeo pG8SAET, sendo testadas algumas abordagens para clonagem como a ligação entre extremidades cegas (blunt-end) e técnicas baseadas em ligação entre extremidades coesivas, incluindo a obtenção de ORESTES e a utilização de adaptadores em grampo. Apesar de serem encontradas algumas limitações, a clonagem por ligação blunt-end se mostrou a mais eficiente para a construção de bibliotecas, sendo adotada para a construção de três bibliotecas em maior escala. A seleção de novas possíveis adesinas a partir das bibliotecas construídas foi realizada em células eucarióticas através da metodologia BRASIL. A primeira biblioteca (BBT1) exibiu 106 clones totais, a partir da qual foram selecionados quatro proteínas em fase apenas com a proteína VIII do fago (pVIII). No entanto, nenhuma delas seria exposta por programas de predição na bactéria. Outras duas bibliotecas foram construídas (BBT2 e BBT3), as quais obtiveram um número ideal de clones para uma ampla cobertura do genoma (>2x107 clones). Por apresentar maior proporção de clones válidos, a BBT2 foi utilizada para a seleção de adesinas, resultando em onze clones em fase com pVIII e/ou sequência sinal do fago. Análises por programas de predição revelaram três proteínas hipotéticas, denominadas LepA962, LepA069 e LepA388, as quais poderiam estar expostas ou ser secretadas pela bactéria, sugerindo uma possível função de adesina. O estudo da proteína LepA388 levou ao reconhecimento de outras doze proteínas semelhantes e pertencentes a uma família paráloga contendo um domínio denominado DUF_61, motivo de função desconhecida presente em proteínas compartilhadas somente entre as espécies patogênicas mais virulentas de Leptospira. Por esta razão, a proteína LepA388 foi a mais estudada. A clonagem de três porções da proteína (LepA388P, LepA388NR e LepA388F) para expressão heteróloga resultou em proteínas recombinantes insolúveis e, considerando a riqueza em resíduos de cisteína presente em sua estrutura, não foi possível renaturá-las adequadamente. Diante dos obstáculos encontrados, apenas a porção contendo a sequência apresentada pelo fago (LepA388P) foi utilizada para obtenção de antissoros em camundongos, os quais apresentaram altos títulos, demonstrando a alta imunogenicidade da proteína LepA388P. O reconhecimento de proteínas nativas da família paráloga DUF_61 em extratos de diferentes sorovares de Leptospira não foi observado, assim como sua expressão in vitro a partir de bactérias em diferentes condições de cultivo. Estudos adicionais sobre a expressão in vivo e funções dos membros desta família são necessários para uma compreensão mais ampla de seu papel na biologia de leptospiras e, possivelmente, na patogênese da leptospirose. / Leptospirosis is an emerging infectious disease whose etiologic agents are pathogenic species of the genus Leptospira. Pathogenic leptospires have countless specific genes encoding proteins with unknown functions, suggesting that leptospires have unique virulence factors. Bacterial adhesins are important virulence factors and so the identification of conserved adhesins in pathogenic Leptospira species from shotgun phage display libraries, followed by selection (biopanning) in cells and/or extracellular matrix components, can reveal new antigens and strategies for leptospirosis treatment and prevention. Libraries were constructed using fragmented genomic DNA from L. interrogans and pG8SAET phagemid vector. Cloning approaches included blunt-end ligation and techniques based in cohesive-end ligation, such as ORESTES strategy and hairpin linkers. Despite some limitations, cloning by blunt-end ligation was the most efficient for library construction, being adopted for the construction of three libraries on a larger scale. Selection of new possible adhesins was performed by biopanning of the libraries in eukaryotic cells through BRASIL methodology. The first library called BBT1 exhibited approximately 106 total clones, and its biopanning resulted in four proteins fused to phage protein VIII, but none of them were expected to be exposed by the bacteria. Other libraries were built (BBT2 and BBT3) which reached the expected number of clones to obtain a larger genome representation (> 2x107 clones). Since it showed the highest proportion of positive clones, BBT2 was selected to perform a second biopanning, resulting in eleven proteins fused to phage protein VIII and/or signal peptide. In silico analysis revealed three hypothetical proteins, named LepA962, LepA069 and LepA388, that would be exposed or secreted by the bacteria, suggesting a possible adhesin function. The study of LepA388 protein led to the recognition of twelve other similar proteins belonging to a paralogous family that contains a domain called DUF_61, domain of unknown function that is present in proteins shared only among the most virulent pathogenic species of Leptospira. For this reason, the LepA388 protein was the most studied. The cloning of three portions of the protein (LepA388P, LepA388NR and LepA388F) for heterologous expression resulted in insoluble recombinant proteins, and given the presence of many cysteine residues in its structure, it was not possible to renature them appropriately. In face of the imposed obstacles, only the portion containing the sequence presented by the bacteriophage (LepA388P) was used to obtain antisera in mice, which showed high titers, demonstrating the high immunogenicity of the protein LepA388P. Recognition of native DUF_61 paralogous family proteins in extracts from distinct Leptospira serovars was not observed, as well as its in vitro expression from bacteria cultured in different conditions. Additional studies on the in vivo expression and functions of members of this family are needed for a broader understanding of their role in leptospiral biology and possibly in the pathogenesis of leptospirosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-15122015-091903 |
| Date | 06 November 2015 |
| Creators | Ferreira, Fabiana Lauretti |
| Contributors | Ho, Paulo Lee |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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