<p>Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist
es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu
verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu
den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große
Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat-
(LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht.
Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte
versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels
verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als
Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale
LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB<sub>241</sub>) des
Bakteriums <i>Listeria monocytogenes</i>. Des weiteren sollten die Integrität
und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten
Internalin-Domäne (InlB<sub>321</sub>) untersucht werden. Hierbei handelt es
sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne,
welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit
einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht.</p>
<p>Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige
thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw.
thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden.
Sowohl InlB<sub>241</sub> als auch InlB<sub>321</sub> zeigen einen reversiblen
und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was
die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte.
Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB<sub>321</sub> resultierte im
Vergleich zum InlB<sub>241</sub> in einer Erhöhung der freien Enthalpie der
Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese
Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des
Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch
in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7
kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die
einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und
dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor
während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die <i
style='mso-bidi-font-style:normal'>in vivo</i> Stabilität des Internalin B
spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität
der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen
keine Intermediate vorliegen.</p>
<p>Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und
Fern-UV<span style='color:red'> </span>Circulardichroismus deuteten auf die
Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der
LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand
zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine
Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer
Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem
alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische
Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der
Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste
langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine
starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess
der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing.
Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem
Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten
für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass
Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude
während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer
zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann.</p>
<p>Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die
InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von
Solenoidproteinen verwendet werden können.<span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:
EN-GB'><o:p></o:p></span></p> / <p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>To
understand the processes of protein structure formation, it is necessary to
investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many
folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class
of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins,
has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat
motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of
modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In
the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the
invasion protein internalin B (InlB<sub>241</sub>) from the bacterium <i>Listeria
monocytogenes</i> was characterized using different biophysical techniques. In addition,
the integrity, stability and folding behavior of the so-called
internalin-domain (InlB<sub>321</sub>) was investigated. In this single domain,
which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin
(Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.<span
style='color:red'><o:p></o:p></span></span></p>
<p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>A
complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was
performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding
transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB<sub>241</sub>
and InlB<sub>321</sub> allowed the use of a two-state model for the description
of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB<sub>321</sub>
resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to
4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to
higher denaturant concentration, and from an increase in the <i>m</i>-value,
the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared
to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the
individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and
that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased
stability <i>in vivo</i> without interfering with the functionality of the
protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects
the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments
unfold without significantly populated equilibrium intermediates.<o:p></o:p></span></p>
<p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>Kinetic
measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are
indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding
pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state
showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the
salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the
unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding
kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular
dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first
slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence
on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a
stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics
indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary
double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline
isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of
the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase
occuring in the submillisecond range.<o:p></o:p></span></p>
<p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>The
results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for
the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural
resolution.<o:p></o:p></span></p>
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:253 |
| Date | January 2004 |
| Creators | Freiberg, Alexander |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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