O uso de DNA plasmidial (pDNA) visando a aplicações terapêuticas tem aumentado nos últimos anos. A cromatografia aparece como a técnica de purificação mais comum para obtenção de amostras de pDNA com o elevado grau de pureza exigido. Porém, as resinas cromatográficas disponíveis apresentam ainda uma série de desafios, nomeadamente no desenvolvimento de ligantes específicos e matrizes capazes de acomodar este tipo de molécula. Relativamente à apuração de novos ligantes, alguns estudos têm mostrado o potencial do aminoácido arginina para estabelecer interações específicas e preferenciais com o pDNA. Por outro lado, resinas monolíticas surgem como suportes interessantes devido às suas excelentes propriedades de transferência de massa e altas capacidades de adsorção. Neste estudo, diferentes ligantes baseados em arginina (arginina, di-arginina e tri-arginina) foram imobilizados em resinas de agarose previamente ativadas. Um primeiro estudo de adsorção em batelada foi realizado a fim de avaliar e compreender os mecanismos envolvidos no processo de adsorção dos ácidos nucleicos pDNA e RNA em resina com o aminoácido arginina. Na sequência, apresentamos uma proposta inovadora para o uso de ligantes de arginina em resinas de agarose, em um único passo de purificação em modo negativo a seguir ao passo de concentração por isopropanol. A capacidade da resina para o pDNA foi substancialmente maior do que a obtida para o mesmo tipo de resina no modo positivo, com notória vantagem de capacidade no uso de di-arginina face a arginina com rendimentos próximos de 100% do plasmídeo carregado. Os ligantes di-arginina e tri-arginina foram também imobilizados em resinas monolíticas. Em comparação com o aminoácido arginina, a imobilização dos homopeptídeos nas resinas monolíticas levou ao aumento da capacidade de adsorção (cerca de 2,5 vezes superior) e especicificidade de interações, mostrando-se como uma estratégia promissora para processos de purificação de pDNA. / The use of plasmid DNA (pDNA) for therapeutic applications has increased in recent years. Chromatography appears as the most common purification technique to obtain samples of pDNA with the high degree of purity required. However, the available chromatographic resins still present a series of challenges, namely in the development of specific ligands and matrices capable of accommodating this type of molecule. Regarding the determination of new ligands, several studies have shown the potential of the arginine amino acid to establish specific and preferential interactions with the pDNA. On the other hand, monolithic resins appear as interesting approaches due to their excellent mass transfer properties and high adsorption capacities. In this study, different arginine based ligands (arginine and di-arginine) were firstly immobilized on activated agarose resins. The first part of the work describes the adsorption equilibrium of plasmid DNA adsorption process, as well as the interaction with its main impurity (RNA) on arginine supports in a batch format, in order to compare and gather crucial information about adsorption mechanisms involved in this type of affinity system. Then, a new use for chromatographic bead matrixes based on arginine ligands was proposed, working as an adsorption matrix pDNA purification in negative mode after isopropanol concentration of the sample. The arginine based supports capacity for pDNA under negative mode for pDNA was substantially higher than that obtained with the same type of resin in the conventional positive mode, with a notable advantage of using di-arginine with recovery yields near 100%. The homopeptides (di-arginine and tri-arginine) were also immobilized on functionalized monolithic resins (BIA Separations, Slovenia). Effectively, the immobilization of the arginine homopeptides made the monolithic resins more functional compared to the (mono)arginine based resin, exhibiting greater binding capacities (around 2,5 times higher) and interaction intensities, proving to be a promising strategy for purification processes of pDNA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04092018-134047 |
| Date | 24 May 2018 |
| Creators | Cardoso, Sara Isabel Borges |
| Contributors | Azzoni, Adriano Rodrigues |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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