Tesis para optar al grado de Mag?ster en Ciencias de la Ingenier?a, Menci?n Qu?mica / Memoria para optar al t?tulo de Ingeniero Civil en Biotecnolog?a / La sociedad se enfrenta de forma cada vez m?s fehaciente y cercana a una crisis del modelo energ?tico actual. El uso indiscriminado de combustibles f?siles, y los problemas medioambientales que su uso acarrea han llevado lentamente hacia un cambio de paradigma. Una de las alternativas renovables al uso de estos es la producci?n de bioetanol a partir de desechos lignocelul?sicos. Este proceso, aunque prometedor, presenta problemas en la eficiencia de las etapas de pretratamiento y de hidr?lisis, que no le permiten afianzarse en el mercado energ?tico. En la b?squeda de soluciones, se ha apuntado en los ?ltimos a?os a las prote?nas de hongos capaces de degradar la madera para su consumo. Entre estas, las monooxigenasas l?ticas de polisac?ridos (LPMO) han cobrado gran importancia en el ?ltimo tiempo. Estas son parte importante del proceso de despolimerizaci?n de la celulosa, y su capacidad de aumentar la eficiencia de ?ste las han puesto en el centro de atenci?n.
Este trabajo de tesis tiene como objetivo la b?squeda de nuevas LPMOs desde dos hongos: Fusarium oxysporum y Gloeophyllum trabeum. M?s espec?ficamente, se busc? identificar enzimas de inter?s en el secretoma del hongo y secuenciarlas para su posterior an?lisis in silico.
Estos objetivos se desarrollaron en una primera instancia a trav?s de la b?squeda de medios de cultivo que indujeran la producci?n de celulasas por parte de los hongos. A partir de la biomasa producida en los cultivos se realiz? una extracci?n de RNA, para luego transcribir el mRNA a cDNA. El cDNA fue utilizado en reacciones de PCR con partidores degenerados. Esto tuvo como fin identificar LPMOs de entre las prote?nas transcritas por el hongo. Los genes identificados fueron amplificados usando partidores espec?ficos, y transformados en E. coli unidos a vectores de clonaci?n. Finalmente los genes fueron secuenciados y esta informaci?n se utiliz? para analizar in silico las propiedades de las LPMOs codificadas por los genes clonados.
Se pudo determinar durante el trabajo medios id?neos para la inducci?n de la producci?n de celulasas, y se tuvo la oportunidad de mejorar el proceso de extracci?n de RNA desde hongos. Del proceso de secuenciaci?n se obtuvo las secuencias de un gen perteneciente a G. trabeum y de dos genes pertenecientes a F. oxysporum. Se observ? que las prote?nas que estos codifican poseen los componentes estructurales descritos como indispensables para ser enzimas activas, vale decir las dos histidinas y la tirosina que forman el sitio activo; se estableci? el mapa de restricci?n de los genes, y se realiz? un an?lisis filogen?tico de estos en relaci?n a prote?nas de referencia. Del an?lisis de las secuencias obtenidas se determin? que, seg?n la clasificaci?n vigente, ser?an parte de la subfamilia 3 de las LPMOs. Finalmente, se pudo aproximar mediante herramientas computacionales la estructura tridimensional de estas prote?nas. Se observ? que la estructura predicha sigue los patrones que presentan las LPMOs ya caracterizadas, otro indicador de que se podr?a tratar de enzimas funcionales.
En conclusi?n, se puede decir que se cumplieron los objetivos propuestos en este trabajo. Se logr? identificar y secuenciar dos LPMOs expresadas por F. oxysporum y una por G. trabeum. Asimismo, se logr? realizar un an?lisis en profundidad de las secuencias utilizadas. Este permite suponer que se trata efectivamente de prote?nas con el potencial de mejorar el proceso de producci?n de biocombustibles, y que se debiese seguir al siguiente paso l?gico, que corresponder?a al an?lisis de la funcionalidad de la prote?na nativa o expresada en forma heter?loga, y su rol en la degradaci?n de lignocelulosa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/131999 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Carvajal Loren, Gonzalo Nicol?s |
| Contributors | Salazar Aguirre, Mar?a Oriana, Facultad de Ciencias F?sicas y Matem?ticas, Departamento de Ingenier?a Qu?mica y Biotecnolog?a, Lienqueo Contreras, Mar?a Elena, Olivera Nappa, ?lvaro, Acevedo Cox, Juan |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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