A presença de cultivares indesejáveis em lotes de linhagens de milho não é tolerada, pois compromete a eficiência da multiplicação subsequente para a produção comercial de sementes. A detecção das sementes contaminantes é realizada através de testes para determinação da pureza varietal e/ou genética, os quais, geralmente, são baseados em marcadores morfológicos e bioquímicos. Devido à importância dessa determinação, métodos alternativos eficientes vêm sendo avaliados e, entre esses merecem destaque os baseados em polimorfismo de DNA, visando a obtenção de informações mais consistentes. Nesse sentido, esta pesquisa teve como objetivo principal a comparação da eficiência de marcadores morfológicos e microssatélites para avaliação de pureza varietal de linhagens de milho e a determinação do grau de sensibilidade da técnica de microssatélites para detectar a ocorrência de genótipos contaminantes em lotes de sementes. Utilizaram-se quatro linhagens (L1, L2, L3 e L4) fornecidas pela Dow AgroSciences Ltda., misturadas duas a duas, para a obtenção de níveis de contaminação de 0, 1, 2, 5, 10 e 100%. L1 e L3 foram consideradas linhagens puras, enquanto L2 e L4 foram tratadas como genótipos contaminantes. A avaliação mediante o uso de marcadores morfológicos foi realizada utilizando-se descritores para sementes, plântulas e plantas em diferentes estádios de desenvolvimento. Na técnica de microssatélites utilizaram-se iniciadores específicos para amplificar DNA isolado a partir de amostras constituídas por 100 sementes ou 100 pares de folhas de plântulas. As reações de amplificação foram conduzidas via reação da polimerase em cadeia e o programa de amplificação utilizado foi específico para microssatélites. Para a resolução dos fragmentos utilizaram-se os géis de agarose (3,5%) e poliacrilamida (6%). Com a finalidade de verificar a sensibilidade dos microssatélites em detectar a ocorrência de contaminantes, foram realizadas misturas sucessivas do DNA da linhagem denominada contaminante em DNA da linhagem pura, simulando níveis de contaminação de 0%, 0,01%, 0,013%, 0,02%, 0,04%, 0,1%, 0,2%, 1%, 2%, 5%, 10% e 100%. Foi observado que as características morfológicas de sementes, plântulas ou mesmo plantas, não ofereceram segurança suficiente para a detecção de contaminação em amostras de linhagens de milho. Por outro lado, a técnica de microssatélites apresentou maior eficiência e precisão, permitindo a detecção de níveis de contaminação de até 1%, como o uso de amostras constituídas por sementes e também folhas de plântulas. No experimento simulando misturas com DNA de diferentes genótipos (L1 - L2 e L3 - L4), a técnica de microssatélites foi eficiente em detectar de maneira consistente concentrações de 0,1% da amostra contaminante. Assim, a determinação da pureza varietal em lotes de sementes de linhagens de milho é mais eficiente pela utilização de marcadores microssatélites em comparação aos marcadores morfológicos. / Maize inbred lines seed production has been conducted to avoid the presence of varietal contamination since it compromises the subsequent multiplication phases within the commercial seed program. Contaminant seeds are detected through varietal and/or genetic purity determination tests which are usually based on morphological and biochemical markers, depending on the desired effectiveness. Thus, more efficient alternative approaches have been tested, with special emphasis on those based on DNA polymorphism. In that context, the main objective of this research was to compare the efficiency of morphological and microsatellite markers to evaluate varietal purity of maize inbred lines and to determine the sensitiveness of the microsatellite technique to detect the occurrence of contaminant genotypes in seed lots. There were used four inbred lines (L1, L2, L3 and L4) supplied by Dow AgroSciences Ltd., mixed to attain contamination levels of 0, 1, 2, 5, 10 and 100%. L1 and L3 were considered pure strains while L2 and L4 were treated as contaminant genotypes. For the morphological marker evaluation seed, seedling and plant descriptors at different development stages were used. Specific maize primers were used in the microsatellite technique and the DNA was isolated from samples of 100 seeds or 100 pairs of seedling leaves. The DNA amplification reactions were conducted through polymerase chain reaction, with amplification program especially designed for microsatellites, and for fragments resolution, 3.5% agarose and 6% polyacrilamyde gels were used. Successive mixtures among DNA of contaminant line and pure line (0%, 0.01%, 0.013%, 0.02%, 0.04%, 0.1%, 0.2%, 1%, 2%, 5%, 10%, and 100%) were performed to simulate contamination levels with the objective of verify the microssatellite sensitiveness in detecting the occurrence of contaminants. Morphological characteristics of the seeds, seedlings or plants were less reliable to detect contamination in maize inbred lines than the microsatellite technique; this provides more efficient and accurate evaluation of varietal purity of seed lots. Levels with 1% of contamination were detected by the use of seed and seedling leaf samples. The experiment with mixtures of DNA (L1 - L2 and L3 - L4) using microsatellite technique allowed the consistent detection of 0.1% contaminant DNA concentration. Thus, the determination of varietal purity in maize seed lots is more efficient by using microsatellite markers than morphological markers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-19042005-171334 |
| Date | 13 December 2004 |
| Creators | Ramos, Nilza Patricia |
| Contributors | Camargo, Luis Eduardo Aranha, Marcos Filho, Julio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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