Erst kürzlich wurde der Lipolyse-stimulierte Lipoproteinrezeptor (LSR, engl.
lipolysis-stimulated lipoprotein receptor) als der zelluläre Oberflächenrezeptor
von CDT und Iota-Toxin, zweier Vertreter der Iota-Toxin-Familie der
clostridialen Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine, identifiziert. In dieser Arbeit
sollte geprüft werden, ob CST, ein weiterer Vertreter der Iota-Toxin-Familie,
ebenfalls LSR für den Zelleintritt nutzt.
Zunächst wurden die Toxinkomponenten CSTa und CSTb erstmals
rekombinant hergestellt. Dazu wurden die für CSTa und CSTb codierenden
Genabschnitte mittels PCR amplifiziert und anschließend in einen
Expressionsvektor kloniert. Als Expressionsvektor wurde in dieser Arbeit der
pHis1522-Vektor verwendet. Zur Amplifizierung wurden die Plasmide in E. coli transformiert und anschließend aufgereinigt. Die Proteinexpression erfolgte in B. megaterium, weil dieses Bakterium sich bereits zur Expression anderer clostridialer Toxine bewährt hatte. Zur Aufreinigung der 6xHis-getaggten Proteine wurde die Nickel-Affinitätschromatographie eingesetzt.
Als nächstes wurde gezeigt, dass die rekombinant hergestellten
Toxinkomponenten CSTa und CSTb biologisch aktiv waren. Dazu wurden
CaCo2-Zellen mit CST behandelt und anschließend die Morphologie der Zellen untersucht. CaCo2-Zellen, die mit CSTa und CSTb behandelt wurden, wiesen Vergiftungserscheinungen wie eine typische Zellabrundung auf. Mit dem „Aktin-Nach-ADP-Ribosylierungs-Assay“ und der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von TRITC-Phalloidin-gefärbtem Aktin wurde gezeigt, dass das rekombinant hergestellte CST Aktin-ADP-ribosylierende Eigenschaften besaß.
Nachdem gezeigt war, dass rekombinant hergestelltes CST sich wie ein
biologisch aktives, binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin verhält, konnte
mithilfe der Vergiftung von H1-HeLa(+LSR)-Zellen und nativen H1-HeLa-Zellen, die kein LSR exprimierten, nachgewiesen werden, dass die Wirkung des Toxins LSR-abhängig ist. FACS-Analysen und Kolokalisationsstudien mit Alexa488-gefärbtem CSTb und Antikörper-gefärbtem LSR erbrachten zusätzlich den Beweis, dass CSTb auf der Zelloberfläche an LSR bindet und bei der Aufnahme in die Zellen mit LSR in endozytischen Vesikeln kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das C. spiroforme Toxin (CST) ebenfalls LSR als Rezeptor für den Zelleintritt verwendet.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:13289 |
| Date | 26 August 2014 |
| Creators | Wilczek, Claudia |
| Contributors | Krüger, Monika, Aktories, Klaus, Frey, Joachim, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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