A leucemia mieloide aguda (LMA) compreende um grupo heterogêneo de doenças hematológicas caracterizadas pela expansão clonal de células mieloides imaturas que apresentam diferentes tipos de alterações genéticas e epigenéticas. O diagnóstico requer a identificação de infiltração da medula óssea e/ou sangue por blastos mieloides leucêmicos em frequência igual ou superior a 20% das células nucleadas. Os tratamentos mais frequentemente empregados para a LMA englobam o uso de quimioterapia convencional com uso de citarabina e antraciclinas, bem como agentes imunoterápicos. Embora a pesquisa da biologia da LMA tenha levado ao desenvolvimento de novos agentes direcionados a alvos específicos como as mutações em FLT3, faltam avanços para os pacientes com outras leucemias que não a leucemia promielocítica aguda (LPA). A halofuginona (HF) é um derivado halogenado de febrifugina, que possui propriedades antifibróticas, anticancerígenas, antiinflamatórias e pró-apoptóticas. No presente estudo, avaliamos a indução de apoptose pela HF nas linhagens de LMA Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCI-AML3, verificando a sensibilidade ao tratamento. Verificamos que a linhagem Kasumi-1 foi sensível à atividade pró-apoptótica da HF exibindo dose efetiva 50 DE50 de 125,58 ng/ml, e que as células THP-1 foram resistentes exibindo DE50 de 786,15 ng/ml. As células Kasumi-1 sofreram diminuição significativa da percentagem de células na fase S do ciclo celular, enquanto que as percentagens de células THP-1 em qualquer das fases analisadas não se alterou em comparação às amostras controles tratadas com veículo. Usando a metodologia de Western Blot, foi detectada a ativação da via das caspases com aumento da clivagem de caspase 3 após 3 horas de incubação com HF nas amostras de células Kasumi-1 e após 12 horas para as células THP-1. Bandas correspondentes a forma clivada de PARP foram identificadas em amostras de células Kasumi-1 após 12 horas de tratamento e nas amostras de células THP-1 após 3 horas de tratamento. Usando a metodologia de Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array para rastreio de proteinas fosforiladas pelo tratamento com HF, detectamos que houve modulação de 3 proteínas diferencialmente para as duas linhagens, 9 proteínas moduladas exclusivamente nas células Kasumi-1 e 6 exclusivamente nas células THP-1 . Entre as alterações mais relevantes, destacamos a diminuição da fosforilação de Stat3 e Stat5 nas células Kasumi-1 e a diminuição das formas fosforiladas de p53 nas células THP-1. Nossos achados confirmam o efeito pró-apoptótico da HF, sobretudo nas células Kasumi-1, e sugerem que este efeito envolva a diminuição das fosforilações de Stat3 e de Stat5. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous hematological disorder characterized by the clonal expansion of immature myeloid cells exhibiting different types of genetic and epigenetic alterations. A diagnosis is established when a patient presents >= 20% of blast in the bone marrow or in the peripheral blood. The WHO classifies AML in seven subtypes depending on the morphology, immunophenotype, genetics and clinical presentation of the cells. The most common treatment until nowadays is chemotherapy in combination with cytarabine and anthracycline and furthermore also the application of immunotherapeutic agents. Although researchers have attempted to develop new agents targeting directly specific mutations such as FLT3, further studies are necessary to find new therapeutic approaches for other leukemic subtypes aside from acute promyelocytic leukemia (APL). Halofuginone (HF) is a halogenated derivate of Febrifugine, which is a molecule isolated from the plant Dichroa febrifuga. It has been demonstrated that Halofuginone exhibits antifibrotic, anti-cancerogenic, anti-inflammatory and pro-apoptotic properties. We evaluated the induction of apoptosis of HF in the AML cell lines Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCIAML3, we verified the sensitivity and resistance of these cell lines after treatment, performed a cell cycle analysis, analyzed the activation of proteins associated with apoptosis and the proteins associated with cell proliferation and survival. We established that the Kasumi-1 cell line was sensitive to the treatment of HF displaying a dose IC50 of 125, 58 ng/ml, while the THP-1 cell lines presented resistance displaying a dose IC50 of 786,15 ng/ml . When treated with HF, the Kasumi-1 cell line stopped in the S phase of the cell cycle displaying significant decrease of proliferation, while HF showed no significant on THP-1. Furthermore we performed a western blot and It was demonstrated that the cleavage of caspase 3 appeared after 3 hours of treatment in Kasumi-1 and after 12 hours of treatment in THP-1, while cleavage of caspase 9 appeared after 12 hours in both cell lines. PARP was cleaved in Kasumi-1 after 12 hours of HF treatment, whereas the cleavage of PARP in THP-1 remained the same after 3 hours of treatment. Performing the methodology of Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array we detected 3 proteins modulated in both cell lines, 9 proteins were modulated only in Kasumi-1 cells and 6 in THP-1 cells. Amongst the different tyrosine kinases and signaling pathways that were modulated, we observed that the phosphorylation of Stat3 and Stat5 was diminished in Kasumi-1, while THP-1 presented iii decreased phosphorylation of p53. Our findings confirm that HF exhibits pro-apoptotic effect on Kasumi-1 and is capable of modulating the various proteins important for cell survival.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06012017-164157 |
| Date | 23 September 2016 |
| Creators | Cândido, Larissa Ananias |
| Contributors | Donadi, Eduardo Antonio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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