Les disferlinopaties són un grup de distròfies musculars causades per mutacions al
gen DYSF. El gen DYSF codifica per la proteïna disferlina, la qual s’expressa en
diversos teixits però és especialment important en el múscul esquelètic i en els
monòcits/macròfags.
En aquesta tesi doctoral els objectius principals eren l’estudi de les funcions de la
disferlina mitjançant l’estudi de les seves interaccions amb altres proteïnes, el
desenvolupament de tests per evaluar les funcions de la disferlina i l’estudi del
trasplantament de moll d’os com a possible teràpia cel·lular per les disferlinopaties.
Es varen estudiar les interaccions de la disferlina mitjançant una combinació de
tècniques de forma novedosa. Primer es va estudiar el complex de la disferlina
mitjançant l’electroforesi no desnaturalitzant o tècnica del Blue Native. També es varen
determinar interaccions amb la disferlina mitjançant assaigs d’immunoprecipitació.
Combinant aquestes dues metodologies, hem pogut identificar membres ja coneguts
del complex de la disferlina com ara la proteïna Trim72/MG53 i la caveolina-3 i hem
pogut identificar nous membres del complex, com ara la proteïna motora dineina
citoplasmàtica, la calseqüestrina-1 o la miomesina-2. Per últim, es va estudiar si les
proteïnes identificades com a membres del complex de la disferlina interaccionaven
directe o indirectament amb aquesta mitjançant la tècnica de FLIM-FRET
(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy- Fluorescence Resonance Energy
Transfer). Gràcies al FLIM-FRET hem descrit el tipus d’interacció entre diverses
proteïnes del complex i la disferlina, determinant que aquesta interacciona directament
amb la calseqüestrina-1, la miomesina-2 la dineina i el trim72/MG53, i hem descrit com
a indirecte la interacció entre la disferlina i la caveolina-3. Això ens a dut a relacionar la
disferlina amb funcions en la regulació del calci per part del reticle sarcoplàsmic,
l’estabilitat de les miofibretes i el tràfic de vesícules.
Per altra banda em desenvolupat diferents metodologies per tal d’avaluar el correcte
funcionament de la disferlina in vitro tant en miotubs com en macròfags. Per avaluar la
correcta funció de la disferlina en miotubs hem posat a punt un assaig de lesió de
membrana basat en l’ús de SDS, després del qual hem pogut observar, que en
absència de disferlina s’acumula el marcador lisosomal Lamp-1 a la membrana, i les
cèl·lules deficients en disferlina presenten una major permeabilitat al iodur de propidi.
A l’estudiar l’efecte de la falta de disferlina en el macròfags varem observar que la falta
d’aquesta proteïna causa que aquest tipus cel·lular es mogui mes ràpidament in vitro.
Per últim, hem comprovat que el trasplantament de moll d’os en un model murí de
disferlinopatia amb cèl·lules d’un donant amb expressió de disferlina normal restaura
l’expressió de disferlina en els monòcits/macròfags però no en el teixit muscular.
També hem comprovat que això comporta una millora funcional en aquest model murí,
tot i que també varem observar certa millora en els animals autotrasplantats.
Per tant, en aquest estudi concluïm amb noves interpretacions de les funcions de la
disferlina basant-nos en els nous membres del complex de la disferlina identificats en
els nostres estudis. Per altra banda, descrivim l’efecte beneficial per se del
trasplantament de moll d’os en un model murí de disferlinopatia així com la major
milloria en aquells animals en els quals s’ha restaurat l’expressió de disferlina en sang
perifèrica. / Dysferlinopathies are a group of muscular dystrophies caused by mutations in the
DYSF gene. The DYSF gene encodes the protein dysferlin, which is expressed in
several tissues but is essential in skeletal muscle and monocytes / macrophages.
The main objectives in this study were to determine the functions of dysferlin by
studying its interactions with other proteins, developing tests to evaluate the functions of
dysferlin, and studying bone marrow transplantation as a possible cell therapy for
dysferlinopathies.
We studied the interactions of dysferlin using a combination of techniques in a novel
way. First, we studied the dysferlin complex by Blue Native electrophoresis. We also
determined dysferlin interactions with immunoprecipitation assays. Combining these two
methods, we identified already known members of the dysferlin complex such as the
proteins Trim72/MG53 and caveolin-3, and we identified new members of the complex,
such as motor protein cytoplasmic dynein, calseqüestrin-1 and myomesin-2. Finally, we
studied whether the proteins identified as members of the dysferlin complex interacted
directly or indirectly by means of Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy,
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FLIM-FRET) analysis. Using the FLIMFRET
technique, we described the type of interaction between the proteins constituting
the dysferlin complex, determining that dysferlin interacts directly with calseqüestrin-1,
myomesin-2, dynein and trim72/MG53 and we described the interaction between
dysferlin and caveolin-3 as an indirect interaction. This led us to hypothesize about the
functions of dysferlin in the regulation of calcium from the sarcoplasmic reticulum, in the
stability of myofibres, in and vesicle trafficking.
In addition, we developed methodologies to determine the function of dysferlin in
myotubes and macrophages in vitro. We developed a membrane injury test based on
the use of SDS in myotubes. We observed that in the absence of dysferlin the
lysosomal marker Lamp-1 accumulates in the subsarcolemma region, and that
dysferlin-deficient cells show a higher permeability to propidium iodide. When we
studied the effect of the absence of dysferlin in macrophages we observed that the lack
of this protein causes these cells to move faster in vitro.
Finally, we found that bone marrow transplantation in a mouse model of
dysferlinopathies with dysferlin positive cells restores the expression of dysferlin in
monocytes / macrophages, but not in skeletal muscle. We have noted that this implies a
functional improvement in this mouse model, although we also observed some
improvement in animals transplanted autologously.
This study concludes by providing new insights into dysferlin function following our
identification of new members of the dysferlin complex and by describing a beneficial
effect of bone marrow transplantation in a mouse model for dysferlinopathy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/116187 |
| Date | 21 March 2013 |
| Creators | Flix Ordóñez, Bàrbara |
| Contributors | Gallardo Vigo, Eduard, Illa Sendra, Isabel, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Medicina |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 210 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0029 seconds