Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble
du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs
non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides,
classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante
de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup
d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de
doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des
LARNnc dans différents systèmes eucaryotes.
Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la
régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute
affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une
proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression
de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus
PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84.
Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas
connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques
et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement
lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement
efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et
de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil
d'activation du promoteur PHO84.
Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs
(ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7
comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par
l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur
d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à
l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa
sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés
exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins
abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont
rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne
nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en
utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription
des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur.
De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou
l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4.
Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de
l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de
l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur. / Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive
regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein
coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding
RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long
non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts,
whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs
might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the
mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems.
For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in
transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the
unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear
exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84.
It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus,
leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However,
most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription
were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic
approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during
transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient
recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense
and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a
model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the
activation threshold of the gene.
For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs).
eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate
transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA
polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA
function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to
determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα)
mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent
in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with
similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly
chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs
are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does
not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore,
using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of
eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we
revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase
MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our
findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required
to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/19322 |
| Date | 05 1900 |
| Creators | Rahman, Samir |
| Contributors | Zenklusen, Daniel |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
Page generated in 0.0026 seconds