CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Em todo o mundo, sÃo registrados mais de 3 milhÃes de acidentes envolvendo picadas de animais peÃonhentos por ano, das quais 125 a 150 mil culminam em Ãbito. No Brasil, a maioria dos casos ocorre com serpentes dos gÃneros Bothrops e Bothropoides, provocando uma grande variedade de complicaÃÃes locais e sistÃmicas, dentre os quais se destacam efeito mionecrÃtico, coagulaÃÃo intravascular disseminada, citotoxicidade, insuficiÃncia renal aguda e sepse. A serpente Bothropoides insularis à uma espÃcie nativa da Ilha de Queimada Grande, cujo veneno apresenta efeito tÃxico acentuado em diversos modelos experimentais. Entretanto, pouco à conhecido a respeito do efeito dessa peÃonha sobre cÃlulas com funÃÃo de defesa, nem o quanto esse efeito pode influenciar na toxicidade observada in vivo. O presente trabalho teve como objetivo investigar as alteraÃÃes celulares induzidas pelo veneno total da serpente Bothropoides insularis (BinsVT) sobre macrÃfagos murinos da linhagem RAW 264.7. Nesse contexto, foi realizada a determinaÃÃo da atividade proteolÃtica e da produÃÃo de perÃxido de hidrogÃnio in vitro de BinsVT atravÃs de reaÃÃes colorimÃtricas. Os resultados demonstraram alta atividade catalÃtica em ambos os testes, sugerindo que os efeitos biolÃgicos desse veneno podem estar relacionados à presenÃa de enzimas como metaloproteinases (svMPs) e L-aminoÃcido oxidases (LAAOs) em concentraÃÃes relevantes nas condiÃÃes experimentais adotadas. A determinaÃÃo do potencial citotÃxico foi realizada pelo mÃtodo de reduÃÃo do MTT, um teste de avaliaÃÃo da capacidade oxirredutora das cÃlulas, apÃs 2, 6, 12 e 24 horas de incubaÃÃo. Foi observado efeito citotÃxico em altas concentraÃÃes de forma tempo-dependente, com morte celular mais pronunciada nas concentraÃÃes de 200 e 100 Âg/mL apÃs 12 e 24 horas de tratamento. Nas menores concentraÃÃes estudadas, ocorreu um aumento gradativo da viabilidade celular, com valores percentuais em torno de 200% em relaÃÃo ao grupo controle nos grupos tratados por 24 horas. Esse resultado sugere a presenÃa de efeito proliferativo de BinsVT sobre essa linhagem celular. Em seguida, a atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante de cultivo dos grupos experimentais foi determinado para investigaÃÃo de lise celular induzida por BinsVT. Foi verificado aumento significativo da atividade dessa enzima em todos os grupos testados, sugerindo a coexistÃncia de fraÃÃes com efeito proliferativo e citotÃxico, e a concentraÃÃo e o tempo de exposiÃÃo do veneno determinam qual irà prevalecer. Para avaliaÃÃo morfolÃgica das cÃlulas RAW 264.7 apÃs exposiÃÃo à substÃncia em estudo, os experimentos foram realizados na superfÃcie de lamÃnulas, para coloraÃÃo com May-Grunwald Giemsa. Os grupos experimentais foram analisados por microscopia Ãptica e as caracterÃsticas morfolÃgicas mais representativas foram fotomicrografadas. Foram observadas diversas alteraÃÃes morfolÃgicas, tais como aparecimento de fragmentos celulares e nÃcleos desnudos, cÃlulas vacuolizadas, reduÃÃo do volume celular e aumento de projeÃÃes citoplasmÃticas. Por fim, o mecanismo de morte celular induzida por BinsVT foi avaliado por citometria de fluxo, pela marcaÃÃo com o iodeto de propÃdio (PI) e a anexina V-FITC. A anÃlise revelou a presenÃa de envolvimento necrÃtico e apoptÃtico no efeito citotÃxico da substÃncia, alÃm do aparecimento de cÃlulas marcadas duplamente com PI e anexina-FITC, indicando a ocorrÃncia de apoptose tardia. Em conclusÃo, BinsVT apresenta efeito citotÃxico sobre macrÃfagos RAW 264.7, com aparente envolvimento de necrose e apoptose, alÃm de provÃvel efeito estimulatÃrio sobre essas cÃlulas, de forma concentraÃÃo- e tempo-dependente. Esses efeitos podem estar relacionados Ãs atividades enzimÃticas encontradas in vitro. / Around the world, there are recorded over 3 million accident involving bites of venomous animals per year, of which 125 to 150 thousand culminate in death. In Brazil, most cases occur with snakes from Bothrops and Bothropoides genus, causing several local and systemic complications, such myotoxicity, disseminated intravascular coagulation, cytotoxicity, acute renal failure and sepsis. Bothropoides insularis is a snake from Queimada Grande Island, whose venom shows pronounced toxicity. However, its effect over cells with defense function remains unclear, as well as how these effects can influence the toxicity observed in vivo. The present study aimed to investigate the cellular changes induced by Bothropoides insularis whole venom (BinsVT) over murine macrophage from RAW 264.7 lineage. In this context, colorimetric tests were performed to determine proteolytic activity and the production of hydrogen peroxide in vitro. The results showed high catalytic activity in both tests, suggesting that the biological effects of this venom may be related to the presence of enzymes such metalloproteinases (svMPs) and L-amino acid oxidases (LAAOs) at concentrations relevant in these experimental conditions. The determination of the cytotoxic potential was conducted by MTT reduction assay, a method of assessing redox metabolism, after 2, 6, 12 and 24 hours of incubation. It was observed cytotoxic effect at high concentrations in a time-dependent way, with cell death more evident at 200 and 100 Âg/mL after 12 and 24 hours of treatment. In lower concentrations, there was a gradual increase in cell viability, reaching around 200% of cell viability in groups treated for 24 hours. This result suggests that BinsVT possess proliferative effect over these cells. Then, lactate dehydrogenase (LDH) activity was determined in culture supernatants from experimental groups for investigation of cell lysis induced by BinsVT. It was observed a significant increase in enzymatic activity in all groups, suggesting the coexistence of fractions with cytotoxic and proliferative effect and that concentration and exposure time determine its outcomes. For morphological evaluation of RAW 264.7 cells after exposure to BinsVT, the experiments were performed on the surface of coverslips for staining with May-Grunwald Giemsa method. The experimental groups were analyzed by optical microscopy and the most representative morphological characteristics were photographed. Various morphological changes were observed, such as appearance of cellular debris and bare nuclei, vacuolated cells, reduced cell volume and increased cytoplasmic projections. Finally, the mechanism of cell death induced by BinsVT was assessed by flow cytometry, by staining with propidium iodide (PI) and annexin V-FITC. The analysis revealed the presence of apoptosis and necrosis, and the appearance of doubly labeled cells with Annexin-FITC and PI, indicating the occurrence of late apoptosis. In conclusion, BinsVT has a cytotoxic effect on RAW 264.7 cell, which necrotic and apoptotic mechanisms, besides stimulatory effect on these cells in dose-and time-dependent ways. These effects may be related to the enzymatic activities found in vitro.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:7763 |
| Date | 14 March 2013 |
| Creators | Ramon RÃseo Paula Pessoa Bezerra de Menezes |
| Contributors | Alice Maria Costa Martins, JanaÃna Serra Azul Monteiro Evangelista, ArlÃndia Cristina Lima Nobre de Morais |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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