Dans le laboratoire du Dr. Charron, le gène Mekl a été inactivé par mutagenèse d'insertion et il a été démontré que les embryons Mekl'' mouraient à la mi-gestation à cause d'une vascularisation déficiente du placenta (Giroux et al., 1999). Chez les placentas Mekl'' la structure du labyrinthe (impliqué dans les échanges nutritifs et gazeux entre le fœtus et la mère) est réduite voire quasi-inexistante. Les objectifs de la présente thèse étaient (i) d'étudier en détails le phénotype placentaire Mekl'", (ii) d'étudier la signalisation de la voie ERK/MAPK in vitro dans un modèle cellulaire participant au développement du placenta, et (iii) de générer un allèle conditionnel de Mekl afin de faire le 'rescue' du placenta Mekï'~. Par marquage immunohistochimique, il a été montré qu'il y a plus de cellules apoptotiques et moins de cellules prolifératives dans la région chorion-allantois du placenta Mekt' en comparaison avec les placentas Mekt/+ . Des analyses westerns sur des extraits totaux de placentas ont montré que la voie ERK/MAPK est beaucoup moins activée chez les spécimens Mekl~'~. Chez les placentas Mekl*'*, il a été montré que MEK1/2 sont activés de façon ubiquitaire dans la région du labyrinthe alors que, ERK1/2 sont principalement activés au niveau des syncytiotrophoblastes (SCT). Chez les placentas Mekl'', bien que MEK2 soit fortement activé au niveau de la jonction chorion-allantois, aucune activation de ERK n'est détectée à la jonction chorion-allantois. Par hybridation in situ, en utilisant le gène Gcml comme un marqueur des précurseurs de SCT, il a été montré que chez les placentas Mekl"', les SCT sont déterminés au bon moment, semblent se différencier normalement, mais sont incapables d'envahir le chorion pour guider la formation du réseau vasculaire du labyrinthe. Ces résultats suggèrent l'implication de Mekl dans la migration et/ou la différenciation des SCT. Par ailleurs, nous avons aussi montré que chez les spécimens Mekl1 ''", la p38/MAPK est phosphorylée au niveau des cellules endothéliales entourant les vaisseaux sanguins fœtaux du labyrinthe. Ce résultat concorde avec les données publiées dans la littérature indiquant que la voie p38 /MAPK est impliquée dans l'angiogenèse. L'activation de p38/MAPK chez les placentas Mekl'1 ' semble normale. Nos résultats suggèrent donc que la voie ERK/MAPK serait essentielle pour la morphogenèse de la barrière formée par les SCT alors que la p38/MAPK serait plutôt impliquée dans l'angiogenèse des cellules épithéliales des vaisseaux sanguins du labyrinthe. D'autre part, plusieurs lignées de trophoblastes souches (TS : cellules souches participant activement dans la morphogenèse du placenta) Mekl+/+ et une lignée de TS Mek2'y ' ont pu être dérivés. Cependant, aucun TS Mekl' ' n'a pu être établi et deux des quatre lignées Mekl''' établies dans les conditions de culture de cellules TS, se sont avérées être des cellules embryonnaires souches (ES). Cette observation soulève plusieurs questions intéressantes en rapport au rôle de Mekl dans la prolifération et la différenciation des TS et/ou des cellules ES in vitro. Des travaux sont actuellement en cours dans notre laboratoire pour approfondir ces rôles. Un autre volet du présent projet était d'étudier le rôle de Mekl dans le développement de l'embryon proprement dit, il a été montré que lorsque les cellules ES Mekl'' sont agrégées avec des embryons tétraploïdes on arrive à générer des embryons et des placentas qui se développent normalement jusqu'au stade E13.5. Cependant, cette sauvegarde est incomplète, car l'embryon à E13.5 présente une morphologie légèrement anormale. Pour confirmer ce résultat, un allèle conditionnel chez lequel l'exon 3 de Mekl est flanqué par deux sites loxP (Mekl*10™) a été généré. L'excision de l'exon 3 génère un allèle nul de Mekl (MeklA ). En utilisant une lignée de souris transgénique exprimant la Crerecombinase spécifiquement dans l'épiblaste (Sox2Cre), des embryons MeklA/Aayant un placenta de type sauvage ont été généré. De plus, les souris MeklA/A sont viables et fertiles en l'absence de MEK1. En conclusion, les résultats décrits dans cette thèse suggèrent fortement que Mekl est requis principalement pour le développement des structures extra-embryonnaires du placenta murin. / Previously, it has been shown that Mekï' embryos die between E9.5-10.5 without any major embryonic malformations, while the placenta presented marked reduction in labyrinthine vascularisation (Giroux et al., 1999). By western analyses we showed that the ERK/MAPK pathway is much less activated in the Mekï ' placentas compared to wild type specimens. Our immunohistochemical analyses revealed that in Mekl+/+ placentas, MEKl/2 are ubiquitous and highly activated in the labyrinth (where gaseous and nutrient exchange take place between the fetus and the mother). ERK1/2 are activated mostly in syncytiotrophoblasts (SCT: ultimate barrier separating fetal and maternai blood flows in the labyrinth). In Mekï" placentas, MEK2 is mostly activated in the chorio-allantoic junction while ERK1/2 are activated exclusively in the allantois and not in the chorio-allantoic junction. Mekï'' placentas presented abnormal morphogenesis of the SCT barrier. Indeed, in Mekï'" placentas, we showed that SCT precursors (Gcm/-positive cells) are determined at the right moment (around E8.5), seemed to be able to differentiate but did not seem to be able to invade the chorion. We also showed that in Mekl*'+ specimens, the p38/MAPK pathway is phosphorylated in endothelial cells surrounding the labyrinthine fetal blood vessels. This observation is in accord with data published in literature assigning an important role of the p38/MAPK pathway in angiogenesis. Activation of the p38/MAPK pathway in Mekï' embryos seemed normal. Our results suggest that signaling through Mekl might be essential for SCT barrier morphogenesis. Furthermore, Giroux et al., (1999) showed that Mekï'" mouse embryonic fibroblasts failed to migrate in response to a fibronectin matrix. Hence we were interested to verify the migration and differentiation potentials of a cell type participating actively in placental development, i.e. trophoblast stem cells (TS). We managed to isolate several wild type and one Mekl'' TS cell lines while we did not obtain any Mekï'' TS. Interestingly, the cells obtained from Mekï'' blastocysts were mainly embryonic stem cells (ES). Hence these findings posed new questions concerning the implication of Mekl in the growth and maintenance of TS cells in vitro. Experiments are being carried out in our laboratory to pour light on these interrogations. Furthermore, we wanted to investigate the role of Mekl in the development of the embryo after E10.5. Using the tetraploid aggregation strategy, we were able to generate live E13.5 Mekl' ' embryos, hence suggesting that the Mekl phenotype is probably extra-embryonic and cell-autonomous. We confirmed thèse results by generating a conditional Mekl allele, in which the exon 3 of Mekl is flanked by two loxP sites (Mekla ° xed). By crossing this mouse with transgenic Cre mouse line (Sox2cre) expressing Cre recombinase specifically in the epiblast, we showed that the Mekl null {MeklA/A) mouse is viable and fertile. Our results demonstrate that Mekl is primordial for extraembryonic development in mouse.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/18197 |
| Date | 11 April 2018 |
| Creators | Bissonauth, Vickram |
| Contributors | Charron, Jean |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | xviii, 205 f., application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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