La famille des microARN (miARN) let-7 comprend treize membres qui jouent des rôles critiques dans de nombreux processus biologiques, notamment la différenciation et le développement cellulaires. Plus spécifiquement, ils fonctionnent comme des suppresseurs de tumeurs en ciblant plusieurs oncogènes. La dérégulation des niveaux de miARN let-7 a été associée à diverses maladies humaines, y compris des cancers et des troubles neurodégénératifs. Il est bien établi que Drosha et Dicer, appartenant à la famille des RNases III, sont deux enzymes clés de la voie de maturation des miARN, et qu'un traitement défectueux par ces endoribonucléases pourrait affecter l'expression des gènes. Au cours des dix dernières années, plusieurs recherches ont permis d'identifier les caractéristiques structurales de l'ARN et les protéines qui régulent la voie de maturation des miARN. Cependant, les détails moléculaires menant à la régulation des niveaux d’expression des miARN nécessitent des investigations supplémentaires. L'objectif principal de cette thèse est d'étudier l'activité de clivage in vitro des endoribonucléases Drosha et Dicer envers leurs substrats let-7, en se concentrant sur la façon dont diverses caractéristiques de séquence et de structure affectent leurs activités.
Tout d'abord, un criblage structural de type SHAPE suivi d'investigations thermodynamiques et cinétiques détaillées pour les treize pré-miARN de la famille let-7 ont été réalisés avec une enzyme Dicer purifiée in vitro. Cette étude a révélé que malgré les différences structurales des membres de la famille let-7, Dicer ne discrimine pas entre ses substrats, y compris les pré-miARN avec une extension de 1-nt et 2-nt à leur extrémité 3'. L'ensemble de ces travaux met en évidence la remarquable promiscuité de Dicer vis-à-vis divers pré-miARN de la famille let-7. Deuxièmement, le mécanisme enzymatique du clivage du pré-let-7a-1 a été examiné. Les résultats de la cinétique de l'état stable, de l'état pré-stable et de l'impulsion-chase sont conformes à l'opinion dominante, soutenue par de récentes structures de cryo-EM, selon laquelle le ou les changements de conformation d'un complexe enzyme-substrat dans une conformation catalytiquement productive sont importants pour l'activité de clivage.
Troisièmement, nous avons étudié la séquence et les déterminants structuraux du clivage du pri-let-7 par le complexe microprocesseur (MP) composé de Drosha et de son partenaire obligatoire DGCR8. Sur la base d'études de clivage de plusieurs substrats pri-let-7 avec un complexe MP reconstitué in vitro, il a été constaté que le clivage du pri-let-7g donne des produits multiples. En utilisant des variantes de pri-let-7g, il a été révélé qu'un élément structural conservé de pri-let-7g favorise un clivage improductif, peut-être en raison du clivage de son substrat par la MP dans l'orientation inverse. Cette étude fournit un cadre pour des investigations futures dans l'étude du clivage de pri-let-7g par Drosha et éventuellement l'identification de nouveaux mécanismes de régulation. Dans l'ensemble, nos résultats donnent un aperçu de la façon dont les caractéristiques structurales des pri-miARN et des pré-miARN de la famille let-7 modulent le traitement par Drosha et Dicer et ouvrent la voie à de futures études visant à examiner le rôle des facteurs protéiques dans la régulation de la maturation des miARN let-7. / The let-7 family of microRNAs (miRNAs) comprises of thirteen members that play critical roles in many biological processes, including cell differentiation and development. More specifically, they function as tumor suppressors by targeting several oncogenes. Deregulation in let-7 miRNA levels has been associated with various human diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. It is well established that Drosha and Dicer are the two key enzymes of the miRNA maturation pathway, and that faulty processing by these endoribonucleases could affect gene silencing. Thus, it is crucial to better understand how Drosha and Dicer respectively process the primary miRNAs (pri-miRNAs) and precursor miRNAs (pre-miRNAs) to yield mature miRNAs, and how these enzymes are regulated. In the last decade of miRNA research, several investigations have identified RNA structural features and RNA-binding proteins that regulate the miRNA maturation pathway, adding another layer of regulation in this pathway. However, the molecular detail of this regulation requires further investigations. The main goal of this thesis is to investigate the in vitro processing activity of Drosha and Dicer toward their let-7 substrates, focusing on how diverse sequence and structural features affect their activities.
First, SHAPE structural probing followed by detailed thermodynamic and kinetic investigations for all thirteen pre-miRNAs of the let-7 family were performed with in vitro purified Dicer. Surprisingly, this study revealed that despite structural differences in the pre-let-7 members, Dicer does not discriminate between these substrates, including pre-miRNAs with a 1 nt and a 2-nt overhang at their 3'-end. Additional binding and cleavage investigations of pre let-7 substrates carrying 3'-end modifications (mono- and oligo-uridylation, mono- and oligo-adenylation) were performed to clarify how these modifications affect Dicer binding and cleavage activities. Together, this work highlights the remarkable substrate promiscuity of Dicer toward diverse pre-miRNAs of the let-7 family. Second, the enzymatic mechanism of pre-let-7 cleavage by Dicer was examined using pre-let-7a-1 as a model substrate. The results from the steady-state, pre-steady state and pulse-chase kinetics are consistent with the prevailing view, supported by recent cryo-EM structures, that the conformational change(s) of an enzyme-substrate complex into a catalytically productive conformation are important for cleavage activity.
Third, the sequence and structural determinants of pri-let-7 processing by the Microprocessor (MP) complex composed of Drosha and its obligatory partner DGCR8 were investigated. Based on cleavage studies of several pri-let-7 substrates with an in vitro reconstituted MP complex, it was found that cleavage of pri-let-7g yields multiple products. Using pri-let-7g variants, it was revealed that a conserved structural element of pri-let-7g promotes unproductive cleavage, possibly as a result of the MP cleaving its substrate in the reverse orientation. This study provides the framework for future investigations in studying pri-let-7g processing by Drosha and possibly identifying novel mechanisms of regulation. Overall, our findings provide insights on how the structural features of pri-miRNAs and pre-miRNAs of the let-7 family modulate processing by Drosha and Dicer and pave the way for future studies aimed at examining the role of protein factors in regulating the maturation of let-7 miRNAs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/28687 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Dadhwal, Gunjan |
| Contributors | Legault, Pascale |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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