Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses
fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également
un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire
responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au
transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de
protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI
par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de
lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus
laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a
appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2
est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par
immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition
sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous
avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI
dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de
l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de
transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI
très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin
de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le
rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des
entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de
l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur
SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus
laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin
et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le
MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est
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également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la
constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus
petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également
testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des
membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces
transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif
transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport.
Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas
effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est
incapable de transporter le MI. / Myo-inositol (MI) is an organic solute involved in various aspects of cell
physiology, including cell signaling. It is also known as a compatible osmolyte.
Three secondary active MI cotransporters have been identified; two are Na+-
coupled (SMIT1 and SMIT2) and one is H+-coupled (HMIT). The main aim of this
study was to characterize MI uptake throught SMIT2 as expressed in epithelial
cells and in Xenopus laevis oocytes. In order to achieve the characterization of this
transport system, we used purified brush border membrane vesicles (BBMv)
isolated from rabbit kidney and rat intestine. We first performed a quantification of
mRNA levels in rabbit kidney using real time PCR for both SMIT1 and SMIT2.
We found that SMIT1 is mainly expressed in the renal medulla while SMIT2 is
mainly localized in the renal cortex. This result was confirmed on Western blots
using an antibody raised against SMIT2. Through inhibition studies using selective
substrates for SMIT1 (inhibited by L-fucose) and SMIT2 (inhibited by D-chiroinositol),
we showed that SMIT2 seems to be responsible for all the apical
transport of MI into the proximal convoluted tubule with a Km of 57 ± 14 µM. By
transport studies we established that rabbit intestine seems to lack apical transport
of MI while rat intestine has a very active uptake of this molecule. qRT-PCR
quantification confirmed the absence of MI transporters in rabbit intestine. As for
kidney, SMIT2 seems to be the only transporter responsible for apical MI uptake
in enterocytes with a Km of 150 ± 40 µM. Functional analysis of rat SMIT2
activity, via electrophysiological studies in Xenopus oocytes, demonstrated
similarities to the activities of SMIT2 from rat intestine and rabbit kidney. SMIT2
displays high affinities for MI (270 ± 19 µM), DCI (310 ± 60 µM) and no affinity
for L-fucose. SMIT2 is very sensitive to phlorizin (Pz; 16 ± 7 µM). Although these
functional characteristics essentially confirmed those found in rat intestine, a
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discrepancy exists between the two systems studied. Indeed, the affinity constant
for glucose was approximately 40-fold lower in vesicles than in oocytes. We also
tested the ability of SGLT1 and GLUT5, other sugar transport systems present in
enterocytes apical membranes, to perform MI uptake. Because the inhibition of
these transporters did not alter radiolabeled MI uptake, we concluded that they had
no significant contribution to MI transport in rat intestine. Finally, the basolateral
efflux of MI was not mediated by GLUT2 because when expressed in oocytes, this
transporter was not able to transport MI.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMU.1866/2846 |
| Date | 03 1900 |
| Creators | Aouameur, Rym |
| Contributors | Lapointe, Jean-Yves |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | French |
| Detected Language | English |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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