Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 50-56. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2002. / Titre de l'écran-titre (visionné le 19 mars 2004). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 13 févr. 2008). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Le cotransporteur Na⁺-K⁺-Cl⁻ de type 2 (NKCC2) appartient à la famille des cotransporteurs cation-Cl⁻ (CCC). Il existe en tant que trois variants d'épissage, appelés A, B et F, qui ne diffèrent entre eux que de 32 acides aminés et qui sont tous localisés sur la membrane apicale de l'anse ascendante de Henle (AAH) à l'état homodimérique. Ils sont cependant exprimés de façon différentielle : NKCC2F se retrouve à la partie initiale de l'AAH où il assure une réabsorption importante du NaCl pour le maintien du volume extracellulaire alors que NKCC2A et NKCC2B se retrouvent à la partie distale de l'AAH et dans la macula densa où ils assurent une réabsorption plus modeste du NaCl pour aider au maintien du volume extracellulaire et soutenir la rétroaction tubuloglomérulaire. Comme « A » et « B » se retrouvent dans des types cellulaires communs, nous nous sommes demandé : 1) s'ils pouvaient former des hétérodimères AB dont les caractéristiques de transport ionique différaient de AA et BB et 2) si les quantités relatives de AA, AB et BB pouvaient être régulés pour permettre à l'AAH distale et à la macula densa d'opérer adéquatement à l'intérieur d'un éventail de concentrations ioniques plus large. L'objectif de recherche a donc été de générer des constructions d'ADNc où deux variants sont connectés entre eux par un « linker » inerte pour forcer la formation de dimères AA, AB ou BB, d'exprimer le produit de ces constructions dans des ovocytes de Xenopus laevis et d'en caractériser la cinétique de transport. Nous avons trouvé que des hétérodimères déployaient des caractéristiques fonctionnelles uniques (différentes par rapport à AA ou BB). Les vitesses maximales de transport atteintes par l'hétérodimère AB étaient beaucoup plus élevées que les homodimères AA et BB. Nos données suggèrent ainsi que les sous-unités assemblées coopèrent entre elles durant le processus de transport. Nos données ouvrent aussi la voie sur la possibilité que la quantité d'hétérodimères formés puisse être régulée de manière à permettre un spectre de réponses en fonction des besoins à combler. / The Na⁺-K⁺-Cl⁻ cotransporter type 2 (NKCC2) belongs to the cation-Cl⁻ cotransporter (CCC) family. It exists as three splice variants called A, B and F that differ among each other by 32 residues and that are all localized on the apical membrane of the thick ascending loop of Henle (TALH) as homodimers. However, they are differentially distributed along this nephron segment: NKCC2F is localized in the initial part of the TALH where it ensures substantial NaCl reabsorption to maintain the extracellular fluid volume and NKCC2A and NKCC2B are localized in the distal part of the TALH where it ensure more modest NaCl reabsorption to help in the maintenance of the extracellular fluid volume and support the tubuloglomerular feedback. As "A" and "B" are localized in the same cellular types, we asked ourselves: 1) whether they could form AB heterodimers with transport characteristics that differ from AA and BB and 2) whether the relative quantities of AA, AB and BB formed could be regulated to allow the distal TALH and macula densa to operate adequately within a wider range of ionic concentrations. My research objective was thus to generate cDNA constructs in which the A and/or B variants are connected to each other by an inert "linker" to force the formation of AA, AB or BB by proximity, to express the product of these cDNA constructs in Xenopus laevis oocytes and to characterize the transport kinetics of the NKCC2 produced. We found that AB heterodimers exhibited unique functional characteristics (relative to AA or BB). In particular, maximal transport rates were much higher for the AB heterodimers than for the AA and BB homodimers. Our data therefore suggest that the assembled subunits cooperate with each other during the transport cycle. Our data also pave the way towards the possibility that the quantity of AB heterodimers formed is regulated such that an array of responses are allowed as a function of the needs to be met.

Titre de l'écran-titre (visionné le 28 février 2024) / Dans mon projet de doctorat, nous nous sommes attardés à analyser la dynamique et la fonction mitochondriales chez les cellules du cumulus au cours de la maturation ovocytaire *in vitro* (IVM). On s'intéresse particulièrement à la régulation mitochondriale par l'hormone folliculo-stimulante (FSH) chez les cellules du cumulus porcines au cours de l'IVM. L'objectif de notre étude est de comprendre l'effet de la FSH sur la structure et la fonction mitochondriales au cours de l'IVM étant donné que les milieux de culture *in vitro* sont systématiquement supplémentés par cette hormone. Le but de ce projet de thèse est de comprendre la réponse et l'action mitochondriales chez les cellules du cumulus au niveau fondamental au cours de l'IVM. Le projet a été subdivisé en trois grandes phases afin de répondre à notre objectif de recherche. La première vise à décrire la morphologie et l'organisation tridimensionnelle des mitochondries chez les cellules du cumulus juste après la récolte du matériel biologique soient les complexes ovocyte-cumulus (COCs) en utilisant différentes approches expérimentales. La deuxième phase du projet se veut une évaluation globale et complète de l'impact de l'IVM sur la structure et l'activité mitochondriales chez les cellules du cumulus du complexe ovocyte-cumulus. Dans une troisième et dernière phase, on s'intéresse à l'effet de la FSH sur la structure et la fonction mitochondriales en décrivant la dynamique mitochondriale en réponse à la FSH et en mesurant en temps réel la respiration mitochondriale ainsi que la glycolyse basale dans les COCs. De plus, l'effet d'une étape de pré-IVM en présence des niveaux élevés en AMPc sur la réponse mitochondriale à la FSH a aussi été étudié pour mieux comprendre l'implication de ce second messager, connu comme un régulateur important du processus de reprise méiotique chez l'ovocyte. Les cellules du cumulus ont été étudiées dans un contexte de COC afin de conserver les échanges du matériel (métabolites, nucléotides cycliques) au sein du complexe pour caractériser la réponse mitochondriale au cours de l'IVM. Nous avons décrit un réseau mitochondrial complexe en trois dimensions, chez les cellules du cumulus porcines juste après la récolte du matériel biologique. Ce réseau change de phénotype au cours de l'IVM. L'étude approfondie de ces organelles a montré une régulation rapide de la dynamique et la fonction mitochondriales par la FSH au cours de l'IVM. De plus, la FSH induit un changement métabolique rapide et important chez les cellules du cumulus en stimulant la glycolyse et en diminuant la respiration et l'activité mitochondriale. Les résultats suggèrent également que chez les cellules du cumulus, la réponse mitochondriale à la FSH est inhibée par des niveaux élevés en AMPc au cours d'une étape de pré-IVM. Toutefois, les mêmes conditions en terme d'AMPc résultent en une stimulation de la glycolyse mais d'une manière moins importante que la FSH. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent chez les cellules du cumulus, des mitochondries organisées en réseau hautement complexe qui change de structure en réponse à la FSH au cours de l'IVM. Les données obtenues révèlent également une régulation rapide de la réponse mitochondriale et du métabolisme chez les cellules du cumulus par la FSH au cours de l'IVM. De plus, nos travaux suggèrent que les niveaux élevés en AMPc durant une étape de pré-IVM inhibent la réponse des cellules à la FSH. Ces résultats permettent d'améliorer nos connaissances fondamentales sur la dynamique et la fonction mitochondriales chez les cellules du cumulus et de considérer la réponse mitochondriale dans le processus de maturation ovocytaire *in vitro*. Ces résultats pavent la voie au développement de stratégies d'amélioration de l'activité mitochondriale par la supplémentation des milieux de culture ovocytaire *in vitro* avec des modulateurs de la réponse mitochondriale lors des techniques de reproduction assistée. / In my thesis project, we focused on analyzing mitochondrial dynamics and function in cumulus cells during *in vitro* maturation (IVM). We are particularly interested in mitochondrial regulation by follicle-stimulating hormone (FSH) in pig cumulus cells during IVM. The aim of our study is to understand the effect of FSH on mitochondrial structure and function during IVM since the culture media are supplemented with this hormone. The goal is to understand the mitochondrial response and action in cumulus cells at the fundamental level during IVM. The project was divided into three main phases to meet our research objective. The first phase of the project aims to describe the mitochondrial morphology as well as its three-dimensional organization in cumulus cells just after oocyte-cumulus complexes (COCs) retrieval using different experimental approaches. The second phase of the project intends to be a global and comprehensive assessment of the impact of IVM on mitochondrial structure and activity in cumulus cells of the oocyte-cumulus complex. In a third and final phase, we are interested in the effect of FSH on mitochondrial structure and function by describing the mitochondrial dynamics in response to FSH and by measuring in real time mitochondrial respiration as well as basal glycolysis in COCs. In addition, the effect of a pre-IVM culture step with high cAMP levels on the mitochondrial response to FSH has also been studied to better understand the involvement of this second messenger, known as an important regulator of oocyte meiotic resumption process. Cumulus cells have been studied as COC to maintain material transfer (metabolites, cyclic nucleotides) within the complex and to characterize the mitochondrial response during IVM. We have described a complex mitochondrial network in three-dimension in pig cumulus cells immediately after removal from the follicular environment. This network changes phenotype and morphology during IVM. Extensive study of these organelles has shown rapid regulation of mitochondrial dynamics and function by FSH during IVM. In addition, FSH induces rapid and significant metabolic changes in cumulus cells by stimulating glycolysis and decreasing respiration and mitochondrial activity. The results also suggest that in cumulus cells, high levels of cAMP inhibited the mitochondrial response to FSH during a pre-IVM culture step. However, the same conditions stimulate a partial increase in glycolysis. In conclusion, the results presented in this thesis show in cumulus cells, mitochondria organized in a highly complex network that changes structure in response to FSH during IVM. The data obtained also reveal a rapid FSH regulation of mitochondrial response and metabolism in cumulus cells during IVM. Moreover, our work suggests that high cAMP levels during a pre-IVM culture step inhibit the response of cells to FSH. These results allow to improve our fundamental knowledge about mitochondrial dynamics and function in cumulus cells and to consider the mitochondrial response in *in vitro* oocyte maturation process. These results pave the way for the development of improvement strategies of mitochondrial activity by supplementing *in vitro* oocyte culture media with mitochondrial response modulators during assisted reproduction techniques.

Nos travaux de recherche ont consisté à étudier chez trois mammifères (la vache, la truie et la souris), la distribution des membres de la famille des protéines liées au X-fragile (protéines liant l'ARNm). Selon notre hypothèse, ces protéines seraient impliquées dans la formation et la fonction de transport des extensions cytoplasmique des cellules du cumulus vers l'ovocyte appelées projections transzonales (TZPs). L'étude de la présence de ces protéines (FMRP, FXR1P et FXR2P) dans l'ovaire a révélé une distribution selon le stade folliculaire. Nous avons observé une forte expression de FMRP dans les follicules primordiaux et primaires suivi d'une diminution de celle-ci à partir des follicules secondaires. Une expression faible mais stable de la protéine FXR2P le long de la folliculogenèse et une forte expression de la protéine FXR1P à partir du stade secondaire avec une compartimentation périnucléolaire. Nous avons également caractérisé la présence des protéines CYFIP1 comme ayant la même distribution que FMRP tout au long de la folliculogenèse. Le passage du follicule au stade secondaire étant marqué par la présence du réseau de TZPs, nous avons pu déduire un rôle de FMRP dans la formation des TZPs. Nous avons également pu observer que l'absence de FMRP aune incidence sur le réseau de TZPs en ce qu'elle entraîne l'immaturité de celui-ci. De plus, cette absence semble être en partie compensée par une augmentation de la protéine FXR2P mettant ainsi en évidence un processus essentiel à l'établissement de la compétence au développement supporté par l'infertilité des souris femelles double KO pour les gènes FMR1 et FXR2. Des trois protéines de la famille du X-fragile, FXR1P a été déterminé comme étant le plus abondant à l'intérieur des TZPs. Cette observation nous a permis de supposer une plus grande contribution de ce dernier au transport actif des transcrits. Ces travaux s'inscrivent dans une optique d'approfondissement des connaissances du rôle de soutien des cellules du cumulus. / Using three mammalian animal models (cow, pig, mouse), the focus of my work was to study the role and distribution of members of the Fragile X protein family (mRNA binding proteins) which we hypothesize as being implicated in the establishment and function of transzonal projections network (TZPs) which is a network formed by cytoplasmic extension of cumulus cells (CC) towards the oolemma (OO). Our results show an overall fluctuation in protein abundance during folliculogenesis. We observed high FMRP levels in primordial and primary follicles and declining of those levels in secondary follicles. FXR2P was weakly but stably detected in all stages of folliculogenesis. FXR1P was highly abundant and characterized by a perinucleolar localization starting from the secondary follicle stage. Finally, CYFIP1 showed a similar distribution to FMRP during folliculogenesis. One of the main physical differences of reaching the secondary follicle stage is the noticeable presence of TZP's network. The distribution of FMRP and CYFIP1 in folliculogenesis suggests a role for FMRP and CYFIP1 in the establishment of TZPs. In the absence of FMRP, the TZPs network was noticeably immature in appearance. The absence of FMRP also led to the up regulation of FXR2P in primordial and primary follicles proving that this family has an important role in the ovaries. This was further supported by evidence in the literature of infertility in the absence of both FMRP and FXR2P. Of the three the fragile X protein family members, FXR1P was the most abundant in TZPs suggesting that it is the likely one involved in active transport of mRNA granules from the cumulus cells to the oocyte. This work is part of an effort to deepen our knowledge of the supporting role of cumulus cells.

Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre.