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Communications et partenariat entre cellules du cumulus et ovocyte : rôle des protéines liées au X-fragile

Nenonene, Elolo Ami Karen Jennifer 21 December 2021 (has links)
Nos travaux de recherche ont consisté à étudier chez trois mammifères (la vache, la truie et la souris), la distribution des membres de la famille des protéines liées au X-fragile (protéines liant l'ARNm). Selon notre hypothèse, ces protéines seraient impliquées dans la formation et la fonction de transport des extensions cytoplasmique des cellules du cumulus vers l'ovocyte appelées projections transzonales (TZPs). L'étude de la présence de ces protéines (FMRP, FXR1P et FXR2P) dans l'ovaire a révélé une distribution selon le stade folliculaire. Nous avons observé une forte expression de FMRP dans les follicules primordiaux et primaires suivi d'une diminution de celle-ci à partir des follicules secondaires. Une expression faible mais stable de la protéine FXR2P le long de la folliculogenèse et une forte expression de la protéine FXR1P à partir du stade secondaire avec une compartimentation périnucléolaire. Nous avons également caractérisé la présence des protéines CYFIP1 comme ayant la même distribution que FMRP tout au long de la folliculogenèse. Le passage du follicule au stade secondaire étant marqué par la présence du réseau de TZPs, nous avons pu déduire un rôle de FMRP dans la formation des TZPs. Nous avons également pu observer que l'absence de FMRP aune incidence sur le réseau de TZPs en ce qu'elle entraîne l'immaturité de celui-ci. De plus, cette absence semble être en partie compensée par une augmentation de la protéine FXR2P mettant ainsi en évidence un processus essentiel à l'établissement de la compétence au développement supporté par l'infertilité des souris femelles double KO pour les gènes FMR1 et FXR2. Des trois protéines de la famille du X-fragile, FXR1P a été déterminé comme étant le plus abondant à l'intérieur des TZPs. Cette observation nous a permis de supposer une plus grande contribution de ce dernier au transport actif des transcrits. Ces travaux s'inscrivent dans une optique d'approfondissement des connaissances du rôle de soutien des cellules du cumulus. / Using three mammalian animal models (cow, pig, mouse), the focus of my work was to study the role and distribution of members of the Fragile X protein family (mRNA binding proteins) which we hypothesize as being implicated in the establishment and function of transzonal projections network (TZPs) which is a network formed by cytoplasmic extension of cumulus cells (CC) towards the oolemma (OO). Our results show an overall fluctuation in protein abundance during folliculogenesis. We observed high FMRP levels in primordial and primary follicles and declining of those levels in secondary follicles. FXR2P was weakly but stably detected in all stages of folliculogenesis. FXR1P was highly abundant and characterized by a perinucleolar localization starting from the secondary follicle stage. Finally, CYFIP1 showed a similar distribution to FMRP during folliculogenesis. One of the main physical differences of reaching the secondary follicle stage is the noticeable presence of TZP's network. The distribution of FMRP and CYFIP1 in folliculogenesis suggests a role for FMRP and CYFIP1 in the establishment of TZPs. In the absence of FMRP, the TZPs network was noticeably immature in appearance. The absence of FMRP also led to the up regulation of FXR2P in primordial and primary follicles proving that this family has an important role in the ovaries. This was further supported by evidence in the literature of infertility in the absence of both FMRP and FXR2P. Of the three the fragile X protein family members, FXR1P was the most abundant in TZPs suggesting that it is the likely one involved in active transport of mRNA granules from the cumulus cells to the oocyte. This work is part of an effort to deepen our knowledge of the supporting role of cumulus cells.
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Analyse et régulation mitochondriale chez les cellules du cumulus au cours de la maturation ovocytaire in vitro

Lounas, Amel 01 March 2024 (has links)
Titre de l'écran-titre (visionné le 28 février 2024) / Dans mon projet de doctorat, nous nous sommes attardés à analyser la dynamique et la fonction mitochondriales chez les cellules du cumulus au cours de la maturation ovocytaire *in vitro* (IVM). On s'intéresse particulièrement à la régulation mitochondriale par l'hormone folliculo-stimulante (FSH) chez les cellules du cumulus porcines au cours de l'IVM. L'objectif de notre étude est de comprendre l'effet de la FSH sur la structure et la fonction mitochondriales au cours de l'IVM étant donné que les milieux de culture *in vitro* sont systématiquement supplémentés par cette hormone. Le but de ce projet de thèse est de comprendre la réponse et l'action mitochondriales chez les cellules du cumulus au niveau fondamental au cours de l'IVM. Le projet a été subdivisé en trois grandes phases afin de répondre à notre objectif de recherche. La première vise à décrire la morphologie et l'organisation tridimensionnelle des mitochondries chez les cellules du cumulus juste après la récolte du matériel biologique soient les complexes ovocyte-cumulus (COCs) en utilisant différentes approches expérimentales. La deuxième phase du projet se veut une évaluation globale et complète de l'impact de l'IVM sur la structure et l'activité mitochondriales chez les cellules du cumulus du complexe ovocyte-cumulus. Dans une troisième et dernière phase, on s'intéresse à l'effet de la FSH sur la structure et la fonction mitochondriales en décrivant la dynamique mitochondriale en réponse à la FSH et en mesurant en temps réel la respiration mitochondriale ainsi que la glycolyse basale dans les COCs. De plus, l'effet d'une étape de pré-IVM en présence des niveaux élevés en AMPc sur la réponse mitochondriale à la FSH a aussi été étudié pour mieux comprendre l'implication de ce second messager, connu comme un régulateur important du processus de reprise méiotique chez l'ovocyte. Les cellules du cumulus ont été étudiées dans un contexte de COC afin de conserver les échanges du matériel (métabolites, nucléotides cycliques) au sein du complexe pour caractériser la réponse mitochondriale au cours de l'IVM. Nous avons décrit un réseau mitochondrial complexe en trois dimensions, chez les cellules du cumulus porcines juste après la récolte du matériel biologique. Ce réseau change de phénotype au cours de l'IVM. L'étude approfondie de ces organelles a montré une régulation rapide de la dynamique et la fonction mitochondriales par la FSH au cours de l'IVM. De plus, la FSH induit un changement métabolique rapide et important chez les cellules du cumulus en stimulant la glycolyse et en diminuant la respiration et l'activité mitochondriale. Les résultats suggèrent également que chez les cellules du cumulus, la réponse mitochondriale à la FSH est inhibée par des niveaux élevés en AMPc au cours d'une étape de pré-IVM. Toutefois, les mêmes conditions en terme d'AMPc résultent en une stimulation de la glycolyse mais d'une manière moins importante que la FSH. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent chez les cellules du cumulus, des mitochondries organisées en réseau hautement complexe qui change de structure en réponse à la FSH au cours de l'IVM. Les données obtenues révèlent également une régulation rapide de la réponse mitochondriale et du métabolisme chez les cellules du cumulus par la FSH au cours de l'IVM. De plus, nos travaux suggèrent que les niveaux élevés en AMPc durant une étape de pré-IVM inhibent la réponse des cellules à la FSH. Ces résultats permettent d'améliorer nos connaissances fondamentales sur la dynamique et la fonction mitochondriales chez les cellules du cumulus et de considérer la réponse mitochondriale dans le processus de maturation ovocytaire *in vitro*. Ces résultats pavent la voie au développement de stratégies d'amélioration de l'activité mitochondriale par la supplémentation des milieux de culture ovocytaire *in vitro* avec des modulateurs de la réponse mitochondriale lors des techniques de reproduction assistée. / In my thesis project, we focused on analyzing mitochondrial dynamics and function in cumulus cells during *in vitro* maturation (IVM). We are particularly interested in mitochondrial regulation by follicle-stimulating hormone (FSH) in pig cumulus cells during IVM. The aim of our study is to understand the effect of FSH on mitochondrial structure and function during IVM since the culture media are supplemented with this hormone. The goal is to understand the mitochondrial response and action in cumulus cells at the fundamental level during IVM. The project was divided into three main phases to meet our research objective. The first phase of the project aims to describe the mitochondrial morphology as well as its three-dimensional organization in cumulus cells just after oocyte-cumulus complexes (COCs) retrieval using different experimental approaches. The second phase of the project intends to be a global and comprehensive assessment of the impact of IVM on mitochondrial structure and activity in cumulus cells of the oocyte-cumulus complex. In a third and final phase, we are interested in the effect of FSH on mitochondrial structure and function by describing the mitochondrial dynamics in response to FSH and by measuring in real time mitochondrial respiration as well as basal glycolysis in COCs. In addition, the effect of a pre-IVM culture step with high cAMP levels on the mitochondrial response to FSH has also been studied to better understand the involvement of this second messenger, known as an important regulator of oocyte meiotic resumption process. Cumulus cells have been studied as COC to maintain material transfer (metabolites, cyclic nucleotides) within the complex and to characterize the mitochondrial response during IVM. We have described a complex mitochondrial network in three-dimension in pig cumulus cells immediately after removal from the follicular environment. This network changes phenotype and morphology during IVM. Extensive study of these organelles has shown rapid regulation of mitochondrial dynamics and function by FSH during IVM. In addition, FSH induces rapid and significant metabolic changes in cumulus cells by stimulating glycolysis and decreasing respiration and mitochondrial activity. The results also suggest that in cumulus cells, high levels of cAMP inhibited the mitochondrial response to FSH during a pre-IVM culture step. However, the same conditions stimulate a partial increase in glycolysis. In conclusion, the results presented in this thesis show in cumulus cells, mitochondria organized in a highly complex network that changes structure in response to FSH during IVM. The data obtained also reveal a rapid FSH regulation of mitochondrial response and metabolism in cumulus cells during IVM. Moreover, our work suggests that high cAMP levels during a pre-IVM culture step inhibit the response of cells to FSH. These results allow to improve our fundamental knowledge about mitochondrial dynamics and function in cumulus cells and to consider the mitochondrial response in *in vitro* oocyte maturation process. These results pave the way for the development of improvement strategies of mitochondrial activity by supplementing *in vitro* oocyte culture media with mitochondrial response modulators during assisted reproduction techniques.
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Le rôle des phosphodiestérases dans le follicule ovarien

Sasseville, Maxime. January 1900 (has links) (PDF)
Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.
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Identification of large molecule transfer in cumulus cell - oocyte intercommunication

Macaulay, Angus 23 April 2018 (has links)
Mes travaux explorent, chez la vache, le transfert entre les cellules du cumulus et l’ovocyte des transcrits d’ARN et d’autres larges molécules qui, selon notre hypothèse, pourraient être exportées des cellules somatiques à l’ovocyte, ceci afin de soutenir sa maturation. L’étude des projections transzonales (PTZ) reliant les cellules du cumulus à l’ovocyte a révélé qu’elles sont de morphologie irrégulière, qu’elles peuvent contenir des organelles (mitochondries) et des structures cellulaires (ribosomes) et qu’elles se retractent au cours de la maturation ovocytaire. Des microvésicules pouvant transférer de larges molécules ont été identifiées à la jonction entre les cellules. Pour déterminer si l’ARN est empaqueté préalablement à son transfert entre les cellules, nous avons analysé les transcrits présents dans les PTZ et avons constaté qu’ils se déplacent vers l’ovocyte en maturation. Parmi les transcrits retrouvés dans les PTZ, certains étaient commun à ceux dont l’abondance augmente dans l’ovocyte en cours de maturation de même qu’à ceux retrouvés dans les polyribosomes de l’ovocyte en maturation, suggérant ainsi le transfert et l’utilisation des transcrits provenant des cellules du cumulus. Un transcrit synthétique ajouté aux cellules du cumulus avant qu’elles ne s’attachent à l’ovocyte a été transféré à ce dernier, confirmant ainsi le potentiel des cellules à transférer des ARNm et possiblement leurs protéins associées à l’ovocyte. Nouse avons observé, sur une échelle de temps, que les transcrits sont accumulés dans les PTZ au cours des heures suivant l’abattage de l’animal, mais préalablement à l’aspiration de l’ovocyte. Le retrait des cellules du cumulus et de cette période d’accumulation des transcrits se traduit par un faible taux de maturation des ovocytes. La nécessité d’avoir des vésicules d’ARN transférées à l’ovocyte a été testée grâce à des inhibiteurs de la synthèse d’ARN, de son transport et de la formation des vésicules. L’inhibition de chacune de ces étapes a compromis la maturation des ovocytes. En se penchant sur les mécanismes impliqués dans le transfert des transcrits, nous avons découvert un candidat potentiel jouant un rôle dans l’insuffisance ovarienne précoce. Cette protéine liant les ARNm, Fragile X mental retardation (FMRP), a été retrouvée dans les cellules folliculaires et dans l’ovocyte tout au long de la folliculogenèse et de l’ovogenèse. Nous avons constaté que FMRP s’associe à la machinerie traductionnelle et aux protéines des granules d’entreposage dans l’ovocyte. L’inhibition de la protéine a significativement réduit le taux de blastocyste. En démontrant que des transcrits exogènes contribuent au développement de l’ovocyte et influencent sa maturation, nos recherches ajoutent un niveau de compréhension additionnel aux mécanismes de communication intercellulaire menant à la production de gamètes de bonne qualité. De futures expériences axées la caractérisation du transfert des transcrits et des mécanismes spécifiques en jeu contribuera à accroître notre compréhension de la compétence ovocytaire. / The reports in this thesis explored the potential for large molecule communication between the cumulus cell and the oocyte hypothesizing that large molecules, including RNA, could be transferred to the oocyte for support during maturation. Exploration of the transzonal projections (TZPs) connecting the cumulus cells to the oocyte revealed that they are irregular in shape, can contain large organelles (mitochondria) and small cellular structures (ribosomes), and that these connections retract during oocyte maturation. Microvesicles were identified at the intercellular articulations capable of sharing large molecules between the cells. To determine if RNA is transferring as cargo between cells, nascent as well as total transcripts were evaluated in the TZPs and found moving towards the oocyte during maturation. Of the transcripts found in the TZPs during maturation, some were common to those increasing in abundance in the oocyte during maturation, and on the polyribosomes of the maturing oocyte, thus suggesting transfer and use of cumulus cell transcripts. A synthetic transcript provided to some cumulus cells for reconstruction with, and transfer to the oocyte, confirmed the potential to transfer mRNA and possibly proteins. Temporally, RNA transcripts were found to accumulate in TZPs during the hours post slaughter but prior to oocyte aspiration. Removal of the cumulus cells and this period of accumulation resulted in poor oocyte maturation. The requirement of vesicle mediated RNA transfer to the oocyte was tested. Inhibitors against RNA synthesis, transport, and vesicle formation were explored and found to reduced oocyte maturation. Focusing on mechanisms that could mediate transference, we assessed an RNA binding protein candidate with implications in premature ovarian insufficiency. Fragile X mental retardation protein (FMRP) was found in follicular cells and the oocyte throughout folliculogenesis and oogenesis. Based on known roles in translation control, FMRP was shown associated with translational machinery and storage granule proteins in the oocyte. Knockdown of this protein resulted in compromised rates of blastocyst formation. Knowing that exogenous transcripts contribute to oocyte development, and influence the molecular aspects of oocyte maturation adds another layer to our understanding of intercellular communication in the production of a healthy gamete. Future characterization of the transferred transcripts and the mechanisms in control of this process will improve our understanding of oocyte health and competence.
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Expression génique des cellules du cumulus et compétence ovocytaire au développement

Bunel, Audrey 04 October 2018 (has links)
L'objectif de mon travail de doctorat consistait à explorer l'expression génique du cumulus au regard de la compétence au développement de l'ovocyte bovin. Cette exploration tire son intérêt des nombreuses démonstrations du rôle crucial du cumulus auprès de l'ovocyte mammalien. En premier lieu, nous avons appliqué à des vaches de race laitière, un protocole de stimulation ovarienne permettant la modulation de la compétence ovocytaire, en agissant sur la différenciation folliculaire, via l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Trois variantes de la compétence développementale de l'ovocyte ont ainsi pu être obtenues : acquisition de compétence en cours, compétence acquise et déclin de compétence. En dépit des différences modérées de compétence engendrées, le transcriptome des cellules du cumulus les reflète quand même. Ces variations bien que minimes, de l'expression génique du cumulus, appuient l'idée générale que la compétence ovocytaire serait le résultat non seulement de changements substantiels par l'environnement, mais aussi d'une régulation beaucoup plus fine des mécanismes folliculaires.Suite aux résultats de la première étude, nous avons voulu obtenir un portrait transcriptomique du cumulus plus contrasté. Pour ce faire, des biopsies de cumulus ont été réalisées sur des complexes ovocyte-cumulus (COC) d'abattoir suivis individuellement, de leur maturation à leur développement in vitro, et catégorisés selon que le développement ce soit arrêté à 2-8 cellules – i.e. avant l'activation du génome embryonnaire – ou qu'il se soit poursuivi jusqu'au stade de blastocyste. De cette manière, les cumuli associés à la formation d'un blastocyste, et donc à des ovocytes compétents, montrent une expression génique clairement différente de ceux dont le développement embryonnaire a échoué. Ces différences concernent des fonctions telles que : la modification post-traductionnelle, le repli des protéines, le métabolisme des acides aminés, la dégradation des protéines ou encore l'épuration des radicaux libres qui se trouvent surexprimées dans les cumuli compétents. Dans un troisième temps, c'est l'implication de l'hormone lutéinisante (LH) dans l'expression génique du cumulus qui a été évaluée. Le même protocole que celui de la première étude a été appliqué, en rajoutant cette fois des injections de Cétrorelix afin de supprimer la sécrétion de LH en fin de croissance folliculaire – i.e. lors de l'acquisition de la compétence au développement. Bien que l'absence de LH n'ait pas eu d'impact significatif sur la compétence ovocytaire, le transcriptome du cumulus a lui été significativement affecté. Ainsi, l'expression de fonctions comme la survie, la prolifération ou la croissance du follicule est inhibée par l'absence de LH. Par ailleurs, des fonctions de maintenance cellulaire telles que la transcription, le métabolisme des acides aminés et des protéines, ainsi que la production d'énergie semblent également pâtir de cette absence. Le soutien de la LH serait donc important pour les fonctions du cumulus lors de la maturation finale du follicule. Finalement, la présence du récepteur à la LH (R-LH) dans le cumulus bovin étant controversée dans la littérature, nous avons cherché à suivre l'expression génique de ce R-LH dans les cellules de COC en cours de maturation in vitro. Nous avons également examiné l'expression de la mévalonate kinase (MVK), dont le transcrit est reconnu en tant que régulateur de l'expression du R-LH ; et aussi surveillé l'expression de différentes enzymes stéroïdogènes ainsi que celle du récepteur à la progestérone (PGR). Le suivi d'expression génique a été réalisé à intervalles de trois heures, de 0 à 24 h de maturation, et n'a pour autant pas permis de détecter la présence de transcrits du R-LH dans le cumulus, tandis que l'expression génique de la MVK augmente au cours de la maturation. Les transcrits des enzymes stéroïdogènes STAR et HSD3β, bien que faiblement exprimés, ont été retrouvés ; et l'expression de CYP11A1 et PGR quant à elle augmente pendant la maturation. Ainsi, d'une part, la supplémentation en LH des milieux de maturation ne semble pas pertinente chez le bovin ; d'autre part, le cumulus pourrait être capable d'utiliser le cholestérol pour la stéroïdogenèse et de répondre à une stimulation par la progestérone puisqu'il en exprime le récepteur. Ces travaux participent ainsi à accroître la connaissance du transcriptome spécifique au cumulus bovin et son lien avec la compétence ovocytaire au développement. Enfin, les données acquises ici offrent de nouvelles pistes à explorer afin d'améliorer la qualité ovocytaire, tant in vitro qu'in vivo. / In this thesis report, the cumulus cell gene expression regarding oocyte developmental competence was explored in bovine. This interest is based on the proven crucial role in the differentiation of the cumulus to the mammalian oocyte. First, we applied an ovarian stimulation protocol to dairy cows which allows modulation of oocyte competence using FSH to influence follicular differentiation. Then, three oocyte competency states were obtained: increasing competence, competence acquired and decreasing competence. In spite of moderated competency fluctuations, cumulus cell transcriptome still reflects them. The small variations in cumulus gene expression reinforce the general idea that oocyte competence is the result not only of substantial changes due to the environment, but also of a much finer regulation of follicular mechanisms. Following the results of the first study, we wanted to obtain a more contrasted transcriptomic picture of the cumulus. To do so, cumulus biopsies were performed on slaughterhouse cumulus-oocyte complexes (COC) monitored individually, from their maturation to their in vitro development, and categorized according to whether the development was stopped at 2-8 cells – i.e. the embryonic genome activation – or continued until the blastocyst stage. In this way, the cumuli associated with a blastocyst formation, and therefore with competent oocytes, show a clearly different gene expression from those whose embryonic development has failed. These differences concern functions such as: posttranslational modification, protein folding, amino acid metabolism, protein degradation or free radical scavenging that are over-expressed in competent cumuli. Thirdly, we evaluated the involvement of luteinizing hormone (LH) in cumulus gene expression. The same protocol as that of the first study was applied, with the addition of Cetrorelix injections in order to suppress the LH secretion at the end of follicular growth – i.e. during developmental competence acquisition. Although the absence of LH did not impacted significantly on oocyte competence, the cumulus cell transcriptome was significantly affected. Thus, the expression of functions such as survival, proliferation or follicular growth is inhibited in the absence of LH. In addition, cell maintenance functions such as transcription, amino acid and protein metabolism, and energy production also seem to suffer from this absence. LH support would therefore be important for cumulus functions during the final maturation of the follicle. Finally, because of the controversy found in literature concerning the presence of the LH receptor (LH-R) in bovine cumulus, we sought to follow the gene expression of this LH-R in in vitro maturing COC cells. Also, we examined the expression of mevalonate kinase (MVK), whose transcript is recognized as a regulator of R-LH expression; and monitored the expression of various steroidogenic enzymes as well as that of the progesterone receptor (PGR). Gene expression observation was performed every 3 hours, from 0 to 24 h of maturation, and did not allow the detection of any R-LH transcripts in the cumulus, while MVK gene expression increases during maturation. The transcripts of the STAR and HSD3β steroidogenic enzymes were found, although weakly expressed; and the expression of CYP11A1 and PGR increases during maturation. Thus, on the one hand, LH supplementation of maturation media does not seem relevant in cattle; on the other hand, cumulus may be able to use cholesterol for steroidogenesis and to respond to a progesterone stimulation since it expresses its receptor. This work thus contributes to increase knowledge of the bovine cumulus transcriptome and its link with oocyte developmental competence. Finally, the data acquired here offer new avenues to explore in order to improve oocyte quality, both in vitro and in vivo.
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Régulation des jonctions communicantes chez les complexes ovocyte-cumulus de porc au cours de la maturation in vitro

Santiquet, Nicolas 19 April 2018 (has links)
Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.
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Oocyte competence and cumulus cells gene expression

Assidi, Mourad 17 April 2018 (has links)
La compétence au développement de l'ovocyte consiste en sa capacité à réussir les étapes successives de maturation, de fécondation pour atteindre le stade blastocyste et donner une progéniture en santé. Facteur limitant du développement embryonnaire, la maturation de l'ovule est le fruit d'interactions optimales avec son environnement somatique et hormonal notamment les cellules de cumulus. Ces dernières étant essentielles pour la maturation de l'ovule et considérées comme un miroir pouvant renseigner sur sa qualité. L'apparence de ces cellules figure parmi les principaux critères morphologiques utilisés lors de la sélection du complexe cumulus-ovocyte. Comme de tels critères sont subjectifs et qualitatifs, on envisage ici d'identifier des biomarqueurs exprimés dans le cumulus et permettant une sélection efficace et objective d'ovocytes compétents via une approche génomique. Par conséquent, les cellules du cumulus d'un ovocyte compétent sont considérées comme étant le site privilégié d'événements spécifiques dont l'activation des voies de signalisation et des cascades d'expression génique reflétant la qualité de l'ovule. En faisant recours aux technologies de pointe utilisées en biologie moléculaire telles que les biopuces et la PCR quantitative, et en se servant de logiciels performants pour l'analyse des voies de signalisation, nous nous sommes concentrés sur l'étude des profils d'expression des cellules du cumulus en relation avec la compétence au développement des ovocytes. Le premier objectif de cette thèse était de trouver des gènes exprimés différentiellement dans des conditions de culture qui influencent la compétence et donc associés à de taux de blastocystes élevés. Outre la confirmation de la voie PKC comme principal acteur impliqué dans la compétence ovocytaire, on rapporte ici une liste de candidats communément surexprimés entre les trois traitements de MIV (FSH, PMA, FSH+PMA) et donc ayant de meilleures chances d'être associés au processus moléculaires de l'acquisition de compétence. Le deuxième objectif était l'analyse des gènes exprimés dans les cellules du cumulus suite à l'action du pic de LH in vivo. Comme la LH est essentielle pour la maturation finale in vivo et à la production d'ovocytes de qualité, on s'est intéressé aux gènes différentiellement exprimés dans les cellules de cumulus et associés à la compétence ovocytaire à 6 heures après le pic de LH. Par la suite, l'expression des gènes à ce stade (GVBD) a été comparée à son homologue in vitro (objectif #1) pour générer une liste commune des marqueurs potentiels de compétence des Ill ovocytes à la fois in vivo et in vitro. L'identification de ces biomarqueurs pourrait accroître les connaissances sur les profils d'expression génique dans les cellules du cumulus et servira de préambule à comprendre des séquences d'événements cruciaux du processus moléculaire d'acquisition de la compétence au développement de l'ovocyte. Ces résultats pourraient être un outil précieux pour accroître les rendements de fécondation in vitro et pourraient permettre d'optimiser la stimulation ovarienne in vivo aussi bien chez le bovin que l'humain. Par la suite, on a procédé à une analyse comparative des effets génomiques des deux gonadotrophines autour de la GVBD: FSH in vitro versus LH in vivo. Nous avons mis en évidence, pour la première fois chez le bovin, une possibilité de compensation ou de substitution de la LH par la FSH in vitro. La troisième partie de cette thèse a été l'analyse de l'expression des gènes dans les cellules du cumulus humains collectés juste avant l'ICSI (intracytoplasmic sperm injection) afin d'identifier des biomarqueurs génomiques fiables permettant de prédire de façon précise et non invasive la compétence au développement des ovocytes et de renforcer les critères morphologiques existants. Pour des cellules de cumulus associés à des ovocytes de morphologies similaires et ayant la même biréfringence de la zona pellucida, on a identifié 7 gènes différentiellement associés à des ovules ayant mené à une grossesse. Ces biomarqueurs pourraient devenir un outil quantitatif et non-invasif permettant de distinguer le bon embryon à transférer parmi d'autres ayant des propriétés morphologiques similaires. Un tel embryon devrait faciliter la pratique du transfert mono-embryonnaire, évitant ainsi les grossesses multiples. Finalement, la présente étude a permis d'identifier plusieurs gènes marqueurs et d'explorer leurs voies de signalisation potentielles aussi bien chez le bovin que l'humain. Ces résultats devraient contribuer à enrichir les connaissances actuelles des profils d'expression génique des cellules du cumulus en plus de donner un aperçu des voies moléculaires qui régissent la compétence au développement des ovocytes. Ils pourraient aussi servir à l'identification et la compréhension des voies moléculaires reliés aux subséquents événements de fécondation et de développement embryonnaire précoce dont les mécanismes demeurent encore méconnus.
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Le rôle des phosphodiestérases dans le follicule ovarien

Sasseville, Maxime 13 April 2018 (has links)
Les nucléotides cycliques possèdent un rôle indéniablement important dans les diverses facettes de la physiologie du follicule ovarien. Les nucléotides cycliques servent d’intermédiaires pour la transmission des signaux extracellulaires à l’intérieur de la cellule. Ces seconds messagers sont synthétisés à l’intérieur de la cellule suite à l’activation des récepteurs couplés à des cyclases. La durée et l’intensité de ces signaux sont non seulement modulées par la synthèse via les adénylyl et guanylyl cyclases, mais par l’action des membres de la famille des phosphodiestérases (PDE) qui inactivent les nucléotides cycliques en hydrolysant le lien phosphodiestère entre le groupement phosphate et la position 3’ du désoxyribose. Malgré le partage d’une fonction commune, les 11 types connus de PDE permettent d’obtenir une finesse de régulation des signaux externes par les variations spatio-temporelles du profil d’expression, par les modes de régulation de l’activité et par leur distribution intracellulaire. Ainsi, pour faire avancer notre compréhension de la modulation des signaux utilisant les nucléotides cycliques dans le follicule ovarien, la caractérisation des PDE dans le complexe ovocyte-cumulus dans un contexte de maturation in vitro (MIV) a été entreprise. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser la nature des PDE présentes dans l’ovocyte afin d’illustrer leur rôle de dégradation de l’adénosine monophosphate 3’5’-cyclique (AMPc) dans le déroulement de la maturation nucléaire. Tout d’abord, la presque totalité de l’activité de dégradation d’AMPc présente dans l’ovocyte a été attribuée à PDE3A, quoiqu’aucune variation n’ait été mesurée au cours de la MIV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique à la famille des PDE3 pendant la MIV nous a permis de définir une période se situant entre 15 à 21 heures de MIV où l’ovocyte s’engage irréversiblement dans sa maturation nucléaire. L’inhibition de PDE3 nous a également montré son implication dans le déroulement de la méiose stimulée par un inhibiteur de protéine phosphatase 1/2A. Ces résultats ont démontré le rôle fonctionnel de PDE3A dans la gestion de l’AMPc dans l’ovocyte porcin tout au long de sa MIV. Dans un deuxième temps, la caractérisation des PDE dans les cellules du cumulus pendant la MIV a été réalisée. Nos résultats démontrent que PDE3A subit une augmentation d’expression de l’ARNm et d’activité pendant les 10 premières heures de MIV, soit 5 heures avant l’engagement irréversible de l’ovocyte dans sa maturation nucléaire. De plus, cette augmentation d’expression est dépendante de la présence de choriogonadotrophines équines. L’augmentation a été reproduite par deux facteurs stimulant la production d’AMPc ; la forskoline, et la prostaglandine E2. Cette augmentation a été empêchée par un inhibiteur de la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA). Ces résultats démontrent la présence d’une voie d’autorégulation de l’AMPc présente dans les cellules du cumulus pendant la MIV qui serait dépendante de la voie de signalisation de l’AMPc et de PKA. Dans un troisième temps, la communication intercellulaire entre les cellules du complexe ovocyte-cumulus (COC) pendant la MIV a été étudiée pour avancer notre compréhension de l’influence mutuelle que les deux types cellulaires exercent un sur l’autre. En outre, la communication intercellulaire utilisant les jonctions communicantes serait augmentée dans le COC par une augmentation d’expression de connexine 43 (Cx43) indépendante des gonadotrophines et stimulée par la rupture du contact entre le COC et les cellules de la granulosa murale. Après une période plateau de haute communication, il se produirait une coupure dramatique de la communication intercellulaire simultanément avec la maturation nucléaire de l’ovocyte. Cette coupure serait stimulée par les gonadotrophines et accompagnée par le recrutement de la Cx43 dans des microdomaines lipidiques de la membrane cellulaire. Dans un dernier temps, la dégradation de la guanosine monophosphate 3’5’-cyclique (GMPc) a été étudiée dans le COC pendant la MIV. Les résultats suggèrent la présence d’une PDE hydrolysant le GMPc sensible à Zaprinast et à Sildenafil, deux inhibiteurs spécifiques aux PDE de la famille 5 et 6. Cette activité est augmentée après 24 heures de maturation in vitro et demeure élevée jusqu’à 48 heures. En conclusion, nos études démontrent un profil d’expression de phosphodiestérases ainsi qu’une variation de la communication intercellulaire particulièrement intéressante dans le COC porcin. Ce portrait permet une avancée fondamentale dans notre vision de la gestion des nucléotides cycliques pendant la MIV. Le meilleur contrôle des niveaux de nucléotides cycliques pendant la MIV pourrait nous permettre d’améliorer les techniques de reproduction assistée en permettant un meilleur support de la maturation in vitro des ovocytes chez les espèces domestiques. / Cyclic nucleotides are of paramount importance in diverse aspects of the physiological functions of the ovarian follicle. These secondary messengers are the intracellular intermediates of extracellular signals transmitted by the central nervous system, other endocrine tissues and the ovary itself. The length and intensity of these signals are modulated by the members of the phosphodiesterases (PDE) family, that inactivate cyclic nucleotides by hydrolysing the phosphodiester bond linking the phosphate group to the 3’ position of the desoxyribose moiety. Although they share a common function, the 11 types of PDE are achieving the delicate interpretation of external signals by their spatio-temporal variations of their expression patterns, by their unique activity modulation mecanisms and unique intracellular targeting. To further understand the modulation of cyclic nucleotides-mediated signals in the ovarian follicle, the functional characterization of PDE in the cumulus-oocyte complex (COC) was carried out in a well defined in vitro maturation (IVM) system. First, the PDE expressed in the oocyte were characterized to illustrate their potential role in 3’5’ cyclic adenosine monophosphate (cAMP) degradation during IVM. Nearly all cAMP degradation activity present in the oocyte was attributed to PDE3A, although no variation was measured during IVM. By delaying PDE3-specific inhibitor addition to the media, an oocyte meiotic resumption commitment period was determined from 15 to 21 hours. It has also demonstrated that PDE3A could be implicated in protein phosphatase 1/2A inhibitor-stimulated meiosis progression. These results have allowed us to precise the role of PDE3A in modulating cAMP in porcine oocyte during IVM. However, the absence of PDE3A activity variation in the oocyte during IVM has led us to believe to an active participation of the cumulus cells in the modulation of cAMP in the period preceding oocyte meiotic resumption. Second, the characterization of PDE in cumulus cells during IVM was undertaken. Our results demonstrate that PDE3A undergoes an upregulation after the first 10 hours of IVM, which is 5 hours before oocyte meiotic resumption commitment. Moreover, this upregulation was dependant of pregnant mare serum gonadotropins. The upregulation was also mimicked by cAMP-stimulation agents forskolin and prostaglandin E2 and has been inhibited by a cAMP-dependant protein kinase (PKA). These results suggest the presence of an autoregulatory loop of cAMP in cumulus cells that is activated following the stimulation of the cAMP/PKA signalling pathway during IVM. Third, intercellular communication between the cells of the cumulus-oocyte complex (COC) during IVM was studied to improve our understanding of the influence that the two cell types exert on each other. Gap-junction-mediated intercellular communication is increased in the COC by a gonadotropins-independent connexin 43 (Cx43) upregulation that is triggered by the rupture between cumulus cells and mural granulosa cells. After a sustained high level of communication, it dramatically drops simultaneously with oocyte meiotic resumption between 18 and 22 hours. This communication breakdown is stimulated by gonadotropins and accompanied by Cx43 recruitment to membrane lipid raft microdomains Finally, the degradation activity of 3’5’ cyclic guanosine monophosphate (cGMP) was studied in the COC during IVM. Our results revealed that a cGMP-hydrolysing PDE is present in the COC and it is sensitive to zaprinast and sildenafil, two PDE5- and PDE6-specific inhibitors. This activity was increased after 24 hours of IVM and remained high up to 48 hours. In conclusion, our studies have demonstrated a PDE profile and intercellular communication variations in the COC that is unique to the pig. This portrait brings further the edge of our fundamental knowledge of cyclic nucleotides modulation and transit during IVM. A better control of cyclic nucleotides during IVM could allow the improvement of assisted reproduction technologies and their efficacy in domestic mammals.

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