Les ovocytes bovins incubés in vitro reprennent la méiose alors que ceux incubés en présence de mono-couches de cellules de la thèque demeurent au stade de vésicule germinale (GV). Les présentes expériences ont été menées sur des ovocytes bovins afin de mieux comprendre les facteurs impliqués dans le contrôle de la maturation des ovocytes. Les objectives étaient 1) de déterminer si la morphologie du complexe ovocyte-cumulus (COCs) est corrélée avec les cinétiques de la reprise méiotique suivant une période d’arrêt méiotique induite. 2) Étudier la fonction des inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) spécifiques seuls ou en présence de une monocouche des cellules de la thèque sur l’arrêt méiotique des ovocytes bovins. 3) Étudier le rôle de la voie de signalisation de la protéine kinase A et de la protéine kinase C dans la modulation de la reprise méiotique des ovocytes bovins. 4) Faire une caractérisation plus poussée du facteur d’inhibition sécrété par les cellules de la thèque. Ces études démontrent que les COCs bovins reprennent la méiose plus rapidement après une courte période d’arrêt méiotique que les COCs non traités. Les ovocytes atrésiques ou dénudés sont donc moins nombreux au stage de GV au début de la maturation que les COCs sains ou légèrement atrésiques. Les inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) de type 3 ont maintenu les ovocytes bovins en arrêt méiotique alors que les inhibiteurs de type 4 n’ont eu aucun effet. De plus, la combinaison des inhibiteurs PDE et des cellules de la thèque montre un effet additif. Les COCs incubés avec des cellules de la thèque sont restés en arrêt méiotique alors que ceux incubés en présence de cellules de granulosa ont repris la méiose. Les cellules de la granulosa non traitées ont annulé l’effet inhibiteur des cellules de la thèque sur la maturation des COCs bovins. Par ailleurs, les COCs sont restés en arrêt méiotique lorsque des analogues d’AMPc ont été utilisés en conjonction avec des cellules de granulosa et de la thèque. Finalement, le facteur inhibiteur sécrété par les cellules de la thèque dans le milieu conditionné est (a) insensible à la chaleur, aux enzymes protéolytiques et à un traitement au charbon, (b) sensible à un traitement au chloroforme, (c) concentré dans la fraction plus petite que 1000 daltons du milieu conditionné et (d) les patrons de pics chromatographiques sont différents entre le milieu conditionné et le milieu frais. D’autres études seront nécessaires pour l’isolation complète du facteur(s) inhibiteur(s) sécrété(s) par les cellules de la thèque responsable du maintien de l’arrêt méiotique des ovocytes bovins. / Bovine oocytes incubated in vitro resume meiosis, whereas most of those incubated with theca cell monolayers remain at the germinal vesicle (GV) stage. Experiments were carried out using bovine oocytes to understand the factors involved in the control of oocyte maturation. The objectives were 1) to determine whether or not the morphology of cumulus oocyte complexes (COC) is correlated with the kinetics of meiotic resumption following a period of induced meiotic arrest. 2) To investigate the role of type-specific phosphodiesterase (PDE) inhibitors alone or in conjunction with theca cell monolayers on meiotic arrest of bovine oocytes. 3) To study the role of the protein kinase A and protein kinase C signaling pathways in the control of meiotic resumption of bovine oocytes incubated with granulosa cells, theca cell monolayers or both cell types. 4) To further characterize the inhibitory factor secreted by the theca cell monolayers. These studies show that bovine COCs resume meiosis faster following a short period of induced meiotic arrest than untreated COCs. Atretic or denuded oocytes have fewer oocytes at the GV stage at the onset of maturation compared to healthy or slightly atretic COCs. Type 3 phosphodiesterase (PDE) inhibitors maintained bovine oocytes in meiotic arrest, whereas type 4 PDE inhibitors did not have an effect. Furthermore, PDE inhibitors and the theca cell monolayers show an additive effect. COCs incubated with the theca cell monolayer remained in meiotic arrest, whereas those incubated with granulosa cells resumed meiosis. Untreated granulosa cell abrogate the inhibitory effect of the theca cell monolayers on the maturation of COCs. However, COCs remain in meiotic arrest when cAMP analogs are used in conjunction with both granulosa and theca cells. The inhibitory factor(s) secreted by the theca cell monolayers is (a) not sensitive to heat, proteolytic enzymes and charcoal treatment, (b) sensitive to chloroform treatment, (c) has a Mr less than 1000 daltons and (d) the patterns of chromatographic peaks are different in conditioned medium and fresh medium. Further work is needed to fully isolate and identify the factor produced by the theca cells responsible for maintaining bovine oocytes in meiotic arrest.

Mise en contexte: Pour augmenter le taux de succès du transfert d'embryons chez la vache l'administration de FSH (follicle stimulating hormone) comme un facteur de la superovulation a été étudiée depuis des années. Cependant, dans des récents articles publiés on note que l'utilisation de la superovulation chez la vache peut mettre en péril de la qualité de l'ovocyte au moment de l'ovulation et que la superovulation pourrait causer des anomalies de la stéroïdogénèse folliculaire et une mauvaise préparation de l'ovocyte. De plus elle peut causer de la méthylation aberrante. L'objectif de ce travail est donc d'analyser le rôle potentiel de la FSH sur le transcriptome ovocytaire. Méthode: Les ovocytes bovin sont obtenus soit d'un cycle naturel et ou un cycle superovulé · (299 UI de FSH deux fois par jours en diminuant pendant quatre jours, prostaglandines [22.5 · mg] administrées avec la première dose de FSH pour induire un nouveau cycle oestral) et les ovocytes sont récupérés 2 h pre LH, 6 h post LH et 22 .h post LH. Les ovocytes provenant d'ovocytes superovulés et non superovulés à différents stades de maturation sont extraits et leur ARN transcrit en ADN pour ensuite êtrè hybridés sur une micropuce d'ADNc bovine. Deux profils d'hybridation ont été établis, le premier volet contient trois hybridations avec les ovocytes superovulés, collectés in vivo à 2 h, 6 h et 22 h avec ceux de la nonsuperovulation, le deuxième volet contient quatre hybridations avec les ovocytes superovulés, collectés in vivo à 2 h pre LH, 6 h- et 2'2 h post LH et les ovocytes nonsuperovulés, collectés à la même heure. À partir des hybridations, 13 gènes candidats ont été sélectionnés en lien possible avec la compétence de l'ovocyte. Le RT-PCR en temps réel a été utilisé pour mesurer le niveau ARNm dans différences conditions: ovocytes superovulés et collectés à 2 h pre LH, 6 h post LH, 22 h post LH; ovocytes nonsuperovulés et collectés à 2 h preLH, 6 h post LH, 22 h . post LH. Résultat: Les gènes BTG4, PTTGI, LEOI et .PAPOLA présentent une différence significative au niveau de ARNm dans les ovocytes superovulés quelque soit le temps de maturation. Le GDF9 présente un taux d'ARNm le plus élevé dans les ovocytes collectés à 2 h pre LH et 6 h post LH comparativement à 22 h post LH quel que soit le traitement. La différence dans le niveau d'expression d'ARNm a amélioré nos connaissances de l'expression de gène chez les ovocytes superovulés par FSH et nous fournit un aperçu des voies moléculaires qui sont affectées par la stimulation ovarienne

Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.