La rétinite pigmentaire (RP) résulte en une dégénération progressive de la rétine et représente une cause importante de cécité. La transmission de cette maladie se fait selon différents processus d'hérédité dont une forme liée au chromosome X pour la protéine retinitis pigmentosa 2 (RP2) et une forme autosomique récessive dans le cas de la phosphodiesterase 6 (PDE6). RP2 est une protéine qui stimule la réaction d'hydrolyse du GTP et est probablement impliquée dans le transport des protéines. C'est une protéine de 350 acides aminés qui possède deux sites d'acylation et est localisée principalement à la membrane plasmique. Il existe quelques mutations perturbant cette localisation dont la deletion de la serine 6 qui résulte en une RP. Dans la cascade signalétique visuelle, l'activation de la rhodopsine par un photon mène à l'activation de la (PDE6). La PDE6 activée hydrolyse ensuite le GMPc, ce qui mène à la fermeture des canaux GMPc dépendants et à l'hyperpolarisation de la membrane du photorécepteur. La PDE6 est un tétramère d'environ 220 kDa et est acylée, ce qui permet sa liaison à la membrane. On la retrouve, tout comme la RP2, en partie dans les microdomaines résistant aux détergents. Ces microdomaines, aussi appelés radeaux lipidiques, sont riches en phospholipides saturés et en cholestérol. Toutefois, la liaison préférentielle de la PDE6 et de la RP2 à des phospholipides saturés n'a jamais été démontrée. L'objectif de cette thèse est de caractériser les propriétés de liaison membranaire de ces protéines en utilisant des monocouches de Langmuir. Pour ce faire, une RP2 recombinante a été produite et la PDE6 fut extraite de photorécepteur bovin. L'analyse de l'interaction de RP2 avec le modèle membranaire met en évidence l'affinité particulière de RP2 pour les lipides saturés et une liaison préférentielle au domaine liquide condensé. La PDE6 montre aussi une discrimination face aux phospholipides. De plus, les résultats obtenus en spectroscopie infrarouge montrent différentes orientations de sa structure secondaire en fonction de l'environnement lipidique. En somme, les résultats présentés dans cette thèse permettent de postuler de nouvelles hypothèses concernant l'importance de l'interaction membranaire de la RP2 et la PDE6 en ce qui concerne leur implication dans les différents processus impliqués dans les mécanismes de la vision.

La calcification de la valve aortique (CVA) est l’un des plus importants types de maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Il s’agit notamment de la condition la plus fréquente de valvulopathie cardiaque aux États-Unis et en Europe de l’Ouest. À ce jour, il n’existe aucun agent thérapeutique pour guérir ou prévenir la progression de la maladie et le remplacement chirurgical de la valve aortique est réalisé uniquement pour les patients ayant atteint un stade sévère de la maladie. Un facteur clé dans le processus de calcification est le pyrophosphate inorganique extracellulaire (PPi) qui agit en tant qu’inhibiteur de calcification. Il est donc nécessaire de maintenir les niveaux de PPi à une certaine concentration pour contrôler les dépôts de calcium dans les tissus afin d’éviter la minéralisation pathologique. Des études récentes, réalisées dans le laboratoire du Dr Patrick Mathieu (Faculté de médecine, U. Laval), ont montré qu’une enzyme régulant les niveaux de PPi était impliquée dans la maladie. En effet, une augmentation de l'expression et de l'activité d'une ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase de type 1 (NPP1) favorise le processus de minéralisation dans la valve aortique. L’inhibition de cette enzyme représente donc un enjeu majeur dans le développement de médicaments, d’où la naissance de mon projet dans le design et la synthèse d’inhibiteurs de NPP1. Dans la présente thèse, une librairie de molécules a été développée. Dans un premier temps, la littérature nous a guidés quant au choix d’une structure phare d’inhibiteur. Par la suite, des modifications structurales de cette dernière appuyées par la modélisation moléculaire et les résultats biologiques ont permis d’établir des relations structure-activité pour l’inhibition de NPP1. Enfin, parmi les nombreux inhibiteurs synthétisés, il sera possible de réaliser une étude in vivo pour l’un des composés afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de ce dernier. / Calcific aortic valve disease (CAVD) is one of the most important types of cardiovascular diseases in industrialized countries. In particular, CAVD is the most common heart valve disorder in the United States and Western Europe. So far, there are no therapeutic agents available to cure or prevent progression of aortic valve mineralization and valve replacements are performed only when the disease stage is advanced. Extracellular inorganic pyrophosphate (PPi) acting as an inhibitor of calcification is a key factor in the calcification process. Therefore, PPi levels must be maintained at certain concentration which control calcium deposits in tissues in order to avoid pathological mineralization. Recent studies from Mathieu group (Faculty of medicine, U. Laval) have shown that an enzyme which regulates PPi levels was involved in CAVD. Indeed, an increase of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (NPP1) enzymatic activity promotes mineralization process in the aortic valve. Therefore, NPP1 inhibition represents a major challenge in drug development, hence the origin of my research project for the design and the synthesis of NPP1 inhibitors. In this thesis, a library of compounds has been developed. First, literature was very helpful for choosing a lead compound. Then, structure diversification of this compound supported by molecular modelling and biological results allowed us to establish a structure-activity relationship for NPP1 inhibition. Among the synthesized inhibitors, it will be possible to realize an in vivo study for one of them in order to evaluate its therapeutic potential.

L’objectif de cette thèse était de caractériser le rôle des différentes familles de phosphodiestérases (PDEs), les enzymes de dégradation du 3'-5'- adénosine monophosphate cyclique (AMPc), dans la régulation de la signalisation de l’AMPc dans deux types de cellules musculaires lisses (CMLs), l’aorte de rat (CMLAR) et la vessie de rat néonatal (CMLVRN). Dans les CMLARs en culture, nous avons déterminé le profil d’expression et d’activité des PDE-AMPc. Nous avons alors montré, à l’aide de la technique de FRET basée sur une sonde sensible à l’AMPc pour mesurer l’AMPc en temps réel dans une cellule isolée, que l’inhibition de la PDE4 démasque un effet d’hydrolyse de l’AMPc cytosolique par la PDE1 et la PDE3, alors que les PDE3 et PDE4 agissent de façon synergistique dans le compartiment sous-membranaire. Les mécanismes de cette compartimentation subcellulaire des signaux restent à caractériser.Dans les CMLVRNs, les PDE3 et PDE4 régulent les contractions phasiques, par des mécanismes différents. L’inhibition de la PDE4 limite les contractions stimulées par le carbachol par un mécanisme dépendant de la protéine kinase A, impliquant une augmentation de la fréquence des sparks calciques, qui entrainent l’activation des canaux potassiques BK, assurant en final une diminution des transitoires calciques. Au contraire, l’effet de l’inhibition de la PDE3 implique la protéine kinase G mais par un mécanisme qui reste à définir.En conclusion, ce travail montre que dans les CMLs, les différents familles de PDE-AMPc sont douées de spécificité de fonction et/ou de mécanisme d’action, et participent ainsi à une compartimentation subcellulaire des voies de signalisation. / The aim of the present thesis was to characterize the role of the different families of phosphodiesterases (PDEs), the enzymes degrading 3'-5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP), in controlling the cAMP signalling in two distinct smooth muscle cells (SMCs), the rat aorta SMC (RASMCs) and the rat bladder SMC (RBSMCs).In cultured RASMCs, we firstly characterized the pattern of cAMP-PDE expression and activity. We then showed, by using a FRET-based cAMP sensor to explore cAMP signals in living cells, that PDE4 inhibition unmasks an effect of PDE1 and PDE3 on cytosolic cAMP hydrolyzis, whereas PDE3 and PDE4 act synergistically at the submembrane compartment. The mechanisms of this subcellular compartmentation need to be characterized. In neonatal RBSMCs, we showed that both PDE3 and PDE4 are involved in regulating the phasic contractions albeit through distinct mechanisms. PDE4 inhibition inhibits the carbachol-enhanced contractions through a protein kinase A-dependent pathway involving an increase in Ca2+ sparks frequency which activates BK channels to ultimately decrease Ca2+ transients, whereas PDE3 inhibition acts through a protein kinase G-dependent pathway through a still unknown mechanism.In conclusion, our work shows that in the SMC, the different cAMP-PDE families exhibit a specificity in their function and/or mechanism of action, thus participating to a subcellular signaling compartmentation.

Les lésions du Système Nerveux Central, qu'elles soient accidentelles ou liées à une maladie, sont à l'origine de dégâts irréversibles. En effet, suite à la section des axones, il s'en suit un processus de cicatrisation. Cette « cicatrice gliale » constitue une barrière physique et chimique sollicitant de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires. Les principales cellules la constituant sont les astrocytes, les oligodendrocytes, les microgliocytes et les fibroblastes. Ces cellules surexpriment les protéines de myéline et la sémaphorine 3A (Sema3A), des agents très inhibiteurs de la régénération nerveuse et de la croissance axonale. Par ailleurs, l'hyperactivité des microgliocytes est à l'origine de l'augmentation considérable de la quantité de radicaux libres oxygénés néfastes pour les neurones.<br />Une approche thérapeutique novatrice serait l'utilisation de composés hybrides portant deux activités distinctes. Une activité neurotrophique permettant la neuro-régénération et une activité antioxydante assurant la neuro-protection en piégeant les radicaux libres.<br />Dans cet objectif, cinq séries de molécules hybrides combinant une chaîne grasse Ω-hydroxylée et des noyaux quinol ont été synthétisés. Les alcools gras quinoliques (QFA) C-alkylés, comportant des noyaux quinol polyméthoxylés, ont été obtenu par couplage de Sonogashira entre des arylbromures et des alcynes vrais. Les homologues N- ou O-alkylés ont été obtenus par des réactions de type SN2.<br />Les molécules synthétisés possèdent de très bonnes activités antioxydantes sous leurs formes déméthylés dépassant d'un facteur 100 l'activité antioxydante du Trolox®. Par ailleurs, le QFA15 portant une chaîne latérale à 15 atomes de carbones, est capable de promouvoir une croissance axonale très importante, aussi bien sur substrat permissif que sur substrat inhibiteur tel les protéines de myéline ou la Sema3A. Des études préliminaires du mécanisme d'action ont permis de conclure que le QFA15 sollicite les nucléotides cycliques.

Les nucléotides cycliques possèdent un rôle indéniablement important dans les diverses facettes de la physiologie du follicule ovarien. Les nucléotides cycliques servent d’intermédiaires pour la transmission des signaux extracellulaires à l’intérieur de la cellule. Ces seconds messagers sont synthétisés à l’intérieur de la cellule suite à l’activation des récepteurs couplés à des cyclases. La durée et l’intensité de ces signaux sont non seulement modulées par la synthèse via les adénylyl et guanylyl cyclases, mais par l’action des membres de la famille des phosphodiestérases (PDE) qui inactivent les nucléotides cycliques en hydrolysant le lien phosphodiestère entre le groupement phosphate et la position 3’ du désoxyribose. Malgré le partage d’une fonction commune, les 11 types connus de PDE permettent d’obtenir une finesse de régulation des signaux externes par les variations spatio-temporelles du profil d’expression, par les modes de régulation de l’activité et par leur distribution intracellulaire. Ainsi, pour faire avancer notre compréhension de la modulation des signaux utilisant les nucléotides cycliques dans le follicule ovarien, la caractérisation des PDE dans le complexe ovocyte-cumulus dans un contexte de maturation in vitro (MIV) a été entreprise. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser la nature des PDE présentes dans l’ovocyte afin d’illustrer leur rôle de dégradation de l’adénosine monophosphate 3’5’-cyclique (AMPc) dans le déroulement de la maturation nucléaire. Tout d’abord, la presque totalité de l’activité de dégradation d’AMPc présente dans l’ovocyte a été attribuée à PDE3A, quoiqu’aucune variation n’ait été mesurée au cours de la MIV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique à la famille des PDE3 pendant la MIV nous a permis de définir une période se situant entre 15 à 21 heures de MIV où l’ovocyte s’engage irréversiblement dans sa maturation nucléaire. L’inhibition de PDE3 nous a également montré son implication dans le déroulement de la méiose stimulée par un inhibiteur de protéine phosphatase 1/2A. Ces résultats ont démontré le rôle fonctionnel de PDE3A dans la gestion de l’AMPc dans l’ovocyte porcin tout au long de sa MIV. Dans un deuxième temps, la caractérisation des PDE dans les cellules du cumulus pendant la MIV a été réalisée. Nos résultats démontrent que PDE3A subit une augmentation d’expression de l’ARNm et d’activité pendant les 10 premières heures de MIV, soit 5 heures avant l’engagement irréversible de l’ovocyte dans sa maturation nucléaire. De plus, cette augmentation d’expression est dépendante de la présence de choriogonadotrophines équines. L’augmentation a été reproduite par deux facteurs stimulant la production d’AMPc ; la forskoline, et la prostaglandine E2. Cette augmentation a été empêchée par un inhibiteur de la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA). Ces résultats démontrent la présence d’une voie d’autorégulation de l’AMPc présente dans les cellules du cumulus pendant la MIV qui serait dépendante de la voie de signalisation de l’AMPc et de PKA. Dans un troisième temps, la communication intercellulaire entre les cellules du complexe ovocyte-cumulus (COC) pendant la MIV a été étudiée pour avancer notre compréhension de l’influence mutuelle que les deux types cellulaires exercent un sur l’autre. En outre, la communication intercellulaire utilisant les jonctions communicantes serait augmentée dans le COC par une augmentation d’expression de connexine 43 (Cx43) indépendante des gonadotrophines et stimulée par la rupture du contact entre le COC et les cellules de la granulosa murale. Après une période plateau de haute communication, il se produirait une coupure dramatique de la communication intercellulaire simultanément avec la maturation nucléaire de l’ovocyte. Cette coupure serait stimulée par les gonadotrophines et accompagnée par le recrutement de la Cx43 dans des microdomaines lipidiques de la membrane cellulaire. Dans un dernier temps, la dégradation de la guanosine monophosphate 3’5’-cyclique (GMPc) a été étudiée dans le COC pendant la MIV. Les résultats suggèrent la présence d’une PDE hydrolysant le GMPc sensible à Zaprinast et à Sildenafil, deux inhibiteurs spécifiques aux PDE de la famille 5 et 6. Cette activité est augmentée après 24 heures de maturation in vitro et demeure élevée jusqu’à 48 heures. En conclusion, nos études démontrent un profil d’expression de phosphodiestérases ainsi qu’une variation de la communication intercellulaire particulièrement intéressante dans le COC porcin. Ce portrait permet une avancée fondamentale dans notre vision de la gestion des nucléotides cycliques pendant la MIV. Le meilleur contrôle des niveaux de nucléotides cycliques pendant la MIV pourrait nous permettre d’améliorer les techniques de reproduction assistée en permettant un meilleur support de la maturation in vitro des ovocytes chez les espèces domestiques. / Cyclic nucleotides are of paramount importance in diverse aspects of the physiological functions of the ovarian follicle. These secondary messengers are the intracellular intermediates of extracellular signals transmitted by the central nervous system, other endocrine tissues and the ovary itself. The length and intensity of these signals are modulated by the members of the phosphodiesterases (PDE) family, that inactivate cyclic nucleotides by hydrolysing the phosphodiester bond linking the phosphate group to the 3’ position of the desoxyribose moiety. Although they share a common function, the 11 types of PDE are achieving the delicate interpretation of external signals by their spatio-temporal variations of their expression patterns, by their unique activity modulation mecanisms and unique intracellular targeting. To further understand the modulation of cyclic nucleotides-mediated signals in the ovarian follicle, the functional characterization of PDE in the cumulus-oocyte complex (COC) was carried out in a well defined in vitro maturation (IVM) system. First, the PDE expressed in the oocyte were characterized to illustrate their potential role in 3’5’ cyclic adenosine monophosphate (cAMP) degradation during IVM. Nearly all cAMP degradation activity present in the oocyte was attributed to PDE3A, although no variation was measured during IVM. By delaying PDE3-specific inhibitor addition to the media, an oocyte meiotic resumption commitment period was determined from 15 to 21 hours. It has also demonstrated that PDE3A could be implicated in protein phosphatase 1/2A inhibitor-stimulated meiosis progression. These results have allowed us to precise the role of PDE3A in modulating cAMP in porcine oocyte during IVM. However, the absence of PDE3A activity variation in the oocyte during IVM has led us to believe to an active participation of the cumulus cells in the modulation of cAMP in the period preceding oocyte meiotic resumption. Second, the characterization of PDE in cumulus cells during IVM was undertaken. Our results demonstrate that PDE3A undergoes an upregulation after the first 10 hours of IVM, which is 5 hours before oocyte meiotic resumption commitment. Moreover, this upregulation was dependant of pregnant mare serum gonadotropins. The upregulation was also mimicked by cAMP-stimulation agents forskolin and prostaglandin E2 and has been inhibited by a cAMP-dependant protein kinase (PKA). These results suggest the presence of an autoregulatory loop of cAMP in cumulus cells that is activated following the stimulation of the cAMP/PKA signalling pathway during IVM. Third, intercellular communication between the cells of the cumulus-oocyte complex (COC) during IVM was studied to improve our understanding of the influence that the two cell types exert on each other. Gap-junction-mediated intercellular communication is increased in the COC by a gonadotropins-independent connexin 43 (Cx43) upregulation that is triggered by the rupture between cumulus cells and mural granulosa cells. After a sustained high level of communication, it dramatically drops simultaneously with oocyte meiotic resumption between 18 and 22 hours. This communication breakdown is stimulated by gonadotropins and accompanied by Cx43 recruitment to membrane lipid raft microdomains Finally, the degradation activity of 3’5’ cyclic guanosine monophosphate (cGMP) was studied in the COC during IVM. Our results revealed that a cGMP-hydrolysing PDE is present in the COC and it is sensitive to zaprinast and sildenafil, two PDE5- and PDE6-specific inhibitors. This activity was increased after 24 hours of IVM and remained high up to 48 hours. In conclusion, our studies have demonstrated a PDE profile and intercellular communication variations in the COC that is unique to the pig. This portrait brings further the edge of our fundamental knowledge of cyclic nucleotides modulation and transit during IVM. A better control of cyclic nucleotides during IVM could allow the improvement of assisted reproduction technologies and their efficacy in domestic mammals.

Les nucléotides cycliques sont des seconds messagers intracellulaires possédant une grande importance dans la signalisation cellulaire du follicule ovarien. Les niveaux intracellulaires en nucléotides cycliques tel que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dépendent de leur synthèse, assurée par l'adenylyl-cyclase (AC) ainsi que leur dégradation par les phosphodiéstérases (PDE). Ces dernières appartiennent à la superfamille des métalophosphohydrolases, elles hydrolysent le groupement phosphate en 3' des nucléotides cycliques pour produire un nucléotide 5' phosphate. Dans les cellules ovariennes, plusieurs familles de PDE ont été identifiées, agissant comme modulateurs des taux intracellulaires de nucléotides cycliques. Dans le présent projet, nous nous attarderons à étudier la signalisation cellulaire chez les cellules ovariennes impliquant l'AMPc. La régulation de ses concentrations intracellulaires affecte plusieurs processus physiologiques. Le projet s'intéresse particulièrement à une famille d'enzyme de dégradation de l'AMPc, la phosphodiestérase8A (PDE8A). Nous voulons donc valider la présence fonctionnelle de la famille de PDE8A dans les cellules ovariennes ainsi que la mitochondrie afin de comprendre l'implication de cette enzyme dans la physiologie cellulaire en s'attardant à la stéroïdogenèse, étant donné que les mitochondries sont un organite cellulaire essentiel pour la stéroïdogenèse parce qu'elles représentent le site de synthèses de plusieurs hormones stéroïdiennes. En effet, des récents travaux ont montré la famille PDE8 comme un régulateur de la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig. Dans cette étude, nous avons montré que le transcrit de PDE8A ainsi que sa protéine étaient exprimés dans les cellules de la granulosa, les cellules du cumulus et l'ovocyte chez le porc. Ainsi, la protéine PDE8a a été détectée par western blot dans des mitochondries isolées à partir des cellules de granulosa et des complexe ovocyte-cumulus (COC). Une co-localisation entre le signal immunoréactive de la PDE8A et le marquage réalisé par mitotracker a été observée dans les cellules de granulosa et des mitochondries isolées. De plus, la présence fonctionnelle de la PDE8 mesurée en tant qu'activité AMPc-PDE sensible au PF-04957325 a été détectée dans des cellules de la granulosa et des mitochondries isolées supportant la présence fonctionnelle de la PDE8A dans les mitochondries isolées. De ce fait, cette observation soutient encore la localisation fonctionnelle mitochondriale de la PDE8A. Une association entre la mitochondrie et la PDE8A a aussi été démontrée par immunomicroscopie électronique qui a confirmé l'ancrage de la protéine sur la membrane mitochondriale externe. Pour évaluer l'implication de la mitochondrie dans la stéroïdogenèse, l'effet de PDE8A sur la production de progestérone a été mesuré dans les complexes ovocyte-cumulus en utilisant le PF-04957325 comme un inhibiteur spécifique de PDE8. Lorsque les COC sont cultivés sans FSH, un niveau basal de progestérone est mesuré. Par contre en présence de FSH une augmentation significative de sécrétion de progestérone est observée. En utilisant un inhibiteur spécifique de la PDE8 (PF-04957325) avec la FSH nous avons obtenu une augmentation encore plus importante de la sécrétion de progestérone. Ces résultats démontrent la présence fonctionnelle de PDE8A dans les cellules de la granulosa et les complexes ovocyte-cumulus. Puisque les mitochondries sont l'une des localisations de PDE8A, l'effet de l'inhibiteur spécifique de PDE8 sur la sécrétion de progestérone soutient la contribution mitochondriale de PDE8 dans la stéroïdogenèse.