This thesis presents a more in-depth understanding of the interaction between the pathogenic fungus Sporisorium scitamineum and sugarcane, a disease known as \"cane smut\". The development of a long structure like a \"whip\" from the meristem of infected plants is the main characteristic of the disease, allowing the effective dispersion of teliospores in the field. Infected plants have a reduced sucrose content and juice quality, leading to considerable economic losses. In the first chapter, the gene expression profile of the pathogen during its development in planta - in the first moments of infection and after the emission of the whip - and in vitro was evaluated using the RNAseq technique. Were analyzed genes preferentially expressed in each condition, differentially expressed in comparison to its growth in vitro, and expressed only during interaction. The results allowed the identification of some potential pathogenicity mechanisms, active effectors and gene clusters expressed only during interaction. In the second chapter, the transient expression technique was used to determine the target cell compartment of some of the candidate effectors and to establish a viable protocol for the study of S. scitamineum proteins. The four putatively secreted genes most expressed during the initial moments of the interaction were fused to the gene encoding the fluorescent green protein (Citrine) and expressed in Nicotiana benthamiana. The results of confocal microscopy and westernblots indicated an accumulation of each candidate protein in the membrane, cytosol and/or nucleus, in addition to the occurrence of post-translational modifications. These data offer new study opportunities for the identification of plant proteins that interact with such effectors. In the third chapter, the transcriptional responses of sugarcane in the first moments of a compatible interaction and after the development of the whip were analyzed using again the data obtained from the dual RNAseq cane-smut. Among the main responses, was identified an increase in MADS-type transcription factors expression, indicating that the whip development may use a route similar to flowering, whose signaling seems to start as early as the colonization. In addition, whip development is accompanied by increased transcription of genes involved in energetic pathways, and hormones synthesis and signaling pathways. Genes encoding RGAs were differentially expressed and may be related to pathogen effector\'s recognition. In the fourth chapter, the metabolic profile of sugarcane was evaluated during disease progression, confirming that in the meristem of infected plants carbon allocation is channeled to energetic pathways, besides the regulation of several amino acids and changes in plant cell composition in response to whip development. Metabolomics approach also allowed the identification of a probable mycotoxin derived from S. scitamineum. The results obtained in this study contributed to increase the understanding of the interaction between S. scitamineum and sugarcane that is characterized by high complexity and specialization to the host, and can be used in a way to help the characterization of resistant varieties and contribute to the improvement of sugarcane with resistance to smut. / Esta tese apresenta uma compreensão mais aprofundada da interação entre o fungo patogênico Sporisorium scitamineum e a cana-de-açúcar, doença conhecida como \"carvão da cana\". O desenvolvimento de uma longa estrutura similar a um \"chicote\" a partir do meristema de plantas infectadas é a principal característica da doença, permitindo a efetiva dispersão dos teliósporos no campo. As plantas doentes apresentam um teor reduzido de sacarose e qualidade do sumo, levando a perdas econômicas consideráveis. No primeiro capítulo, o perfil de expressão gênica do patógeno durante o seu desenvolvimento in planta - nos primeiros momentos da infecção e após a emissão do chicote - e in vitro foi avaliado utilizando a técnica RNA-Seq. Foram analisados os genes preferencialmente expressos em cada condição, diferencialmente expressos em relação ao crescimento em meio de cultura, ou expressos apenas durante a interação. Os resultados permitiram a elaboração de hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade, sobre os genes candidatos a efetores ativos e a identificação de agrupamentos de genes expressos apenas durante a interação. No segundo capítulo, para determinar o compartimento celular alvo de alguns dos efetores candidatos e estabelecer um protocolo viável para o estudo de proteínas de S. scitamineum foi utilizada a técnica de expressão transiente. Os quatro genes mais expressos durante os momentos iniciais da interação que fazem parte do secretoma do fungo foram fusionados ao gene que codifica a proteína verde fluorescente (Citrina) e expressos em Nicotiana benthamiana. Os resultados de microscopia confocal e westernblots indicaram um acúmulo de cada uma das proteínas candidatas na membrana, citosol e/ou núcleo, além da ocorrência de modificações pós-traducionais. Esses dados oferecem novas oportunidades de estudo para a identificação de proteínas vegetais que interagem com tais efetores. No terceiro capítulo, as respostas transcricionais da cana-de-açúcar nos primeiros momentos de uma interação compatível e após o desenvolvimento do chicote foram analisadas utilizando novamente os dados obtidos a partir do dual RNAseq cana-carvão. Entre as principais respostas da cana destacou-se um aumento da expressão de genes que codificam fatores de transcrição do tipo MADS, indicando que o desenvolvimento do chicote pode usar uma rota semelhante à do florescimento, cuja sinalização parece iniciar logo nos primeiros momentos de colonização. Além disso, o desenvolvimento do chicote é acompanhado pelo aumento da transcrição de genes envolvidos em vias energéticas, e vias de síntese e sinalização hormonal. Genes que codificam para RGAs foram diferencialmente expressos e podem estar relacionados ao reconhecimento de efetores. No quarto capítulo, foi avaliado o perfil metabólico da cana-de-açúcar durante a progressão da doença, confirmando que no meristema de plantas infectadas ocorre um aumento da alocação de carbono em vias energéticas, além da regulação de vários aminoácidos e mudanças em relação à composição da parede celular em resposta ao desenvolvimento do chicote. A abordagem metabólica também permitiu a identificação de uma provável micotoxina derivada de S. scitamineum. Os resultados obtidos neste estudo contribuíram para aumentar a compreensão da interação entre S. scitamineum e a cana-de-açúcar que se caracteriza pela alta complexidade e especialização ao hospedeiro, e poderão ser utilizados de forma a auxiliar a caracterização de variedades resistentes e contribuir para o melhoramento da cana-de-açúcar com resistência ao carvão.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-09082017-110317 |
| Date | 17 February 2017 |
| Creators | Schaker, Patricia Dayane Carvalho |
| Contributors | Vitorello, Claudia Barros Monteiro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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