Os gliomas são tumores que surgem a partir de células da glia e são considerados os mais comuns do sistema nervoso central. São subdivididos em quatro grupos: astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (grau IV ou GBM). Entre esses, o GBM é o tumor mais agressivo e mais freqüente. Apesar de ser encontrado em qualquer faixa etária, esse tumor é raro em crianças. Atualmente a cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ) tem sido utilizado como protocolo de tratamento padrão para a maioria dos pacientes e mesmo assim a sobrevida se mantem extremamente baixa. Além disso, grande parte dos pacientes não respondem ao tratamento com TMZ indicando a necessidade de agentes quimioterápicos alternativos. A zebularina (ZB) é um agente inibidor de DNA metiltransferases (iDNMTs) estável, pouco tóxico, que promove radiosensibilização e tem mostrado efeitos promissores em diversos tipos de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito dos efeitos da ZB em glioblastoma. Os objetivos deste trabalho foram analisar a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT em 5 amostras de substâncias brancas (SB), 6 linhagens de GBM e 33 amostras de gliomas (13 grau I, 2 grau II e 18 grau IV), correlacionar a expressão desses genes com os diferentes graus de gliomas e analisar os efeitos da ZB combinada ou não com TMZ em linhagens de GBM irradiadas e não irradiadas. Para análise da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo Real. Os ensaios de proliferação celular, clonogênico, radiação e apoptose foram realizados em 3 linhagens de GBM (U251, SF188 e T98G) e uma de fibroblastos (MRC5). Também foi realizado o ensaio de proliferação celular em 5 culturas primárias de GBM tratadas com zebularina. Os genes DNMT3A e MGMT mostraram expressão maior nas amostras de SB comparando-se com gliomas e linhagens de GBM. O gene DNMT3B foi mais expresso nas linhagens de GBM comparando-se com as SB. O gene DNMT1 não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas. Os ensaios de proliferação celular mostraram diminuição na proliferação com doses a partir de 50-100µM de ZB e de 250-500µM de TMZ nas linhagens e a partir de 50µM de ZB para as culturas primárias de GBM. As combinações de ZB com TMZ não mostraram sinergia na grande maioria das doses testadas. A ZB aumenta a apoptose nas 3 linhagens com doses a partir de 100µM. A ZB e TMZ mostraram diminuição na formação de colônias com as doses de 100µM e 10µM nas linhagens U251 e SF188 não irradiadas e irradiadas com 2, 4 e 6 Gy. A linhagem T98G expressa o gene MGMT, mostrou resistência a 10µM de TMZ e respondeu ao tratamento com 100µM de ZB. Também foi observado que 10µM de TMZ é mais citotóxico do que 100µM de ZB em fibroblastos não irradiados e irradiados (2Gy). Os resultados obtidos neste estudo mostram que a ZB pode representar um alvo terapêutico interessante para o estudo em glioblastoma. / Gliomas arise from glial cells and are the most common central nervous system tumors. They are divided in four groups: pilocytic astrocytoma (grade I), difuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and glioblastoma (grade IV or GBM). GBM is the most frequent and aggressive glioma. This type of tumor can occur in any age but its rare in children. Actually, surgery, radiotherapy and temozolomide (TMZ) adjuvant/concomitant chemotherapy has been the standard treatment protocol but the survival is extremely poor. In addition most patients do not respond to TMZ indicating the need for alternative chemotherapeutic agents. Zebularine (ZB) is a DNA metiltransferase inhibitor (DNMTi) stable, slight toxic that has been showed promise effects in cancer including radiosensitivity but little is known about ZB in glioblastoma. The objectives of this study were analyze DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT gene expression profile in 5 samples of normal brain, 6 GBM cell lines and 33 glioma samples (13 grade I, 2 grade II e 18 grade IV), correlate with different gliomas grades and analyze the effects of ZB isolate and in combination with TMZ in irradiated and non irradiated GBM cell lines. Gene expression assays was made using Real Time PCR. Proliferation, clonogenic, radiation and apoptosis assays were realized in three GBM cell lines (U251, SF88, T98G) and one fibroblast cell line (MRC5). We also made proliferation assays in 5 primary cultures of samples of GMB. MGMT and DNMT3A genes showed higher expression in normal brain compared to gliomas and GBM cell lines. DNMT3B gene showed higher expression in GBM cell lines compared with normal brain and DNMT1 showed no significant differences among samples analyzed. We observed decrease of cell proliferation from 50-100µM of ZB and 250-500µM of TMZ on GBM cell lines and from 50µM of ZB for primary GBM samples. It was not observed synergy in the most combinations doses of ZB and TMZ (Calcusyn software). It was observed that 100µM of ZB and 10µM of TMZ decrease colony formation on U251 and SF188 cell lines non irradiated and irradiated with 2, 4, and 6Gy. T98G that express MGMT, did not respond to TMZ but showed response to ZB. It was also observed that 10µM of TMZ is more cytotoxic than 100µM of ZB in fibroblast cell line non irradiated and irradiated with 2Gy. ZB increase apoptosis from 100µM on the three GBM cell lines. Results obtained in this study can indicate that ZB may be an interestig therapeutic target for future studies in glioblastoma.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-22042013-102215 |
| Date | 24 August 2012 |
| Creators | Daniel Antunes Moreno |
| Contributors | Luiz Gonzaga Tone, Oswaldo Keith Okamoto, Harley Francisco de Oliveira, Rodrigo Alexandre Panepucci, Silvia Regina Caminada de Toledo |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Genética), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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