O glutamato (Glu) é o neurotransmissor excitatório mais abundante do sistema nervoso central e está envolvido em funções cerebrais como aprendizado/memória, desenvolvimento e envelhecimento cerebral. Mudanças na vulnerabilidade neuronal durante o desenvolvimento pós-natal podem ser parcialmente explicadas por mudanças na expressão das subunidades de receptores de Glu (GluRs). O objetivo desse trabalho foi determinar o padrão de expressão das subunidades de GluRs do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) em quatro estruturas cerebrais (cerebelo, córtex, estriato e hipocampo) em diferentes estágios do desenvolvimento pós-natal de ratos por quantificação relativa por PCR em tempo real. Mudanças significativas na expressão de Grin1 foram observadas em quase todas as estruturas em relação aos níveis pós-natais de expressão. Níveis de expressão de Grin2A foram menores no cerebelo com um padrão de aumento gradual e níveis elevados na vida adulta no córtex e no hipocampo. A expressão do Grin2B demonstrou um padrão decrescente no cerebelo assim como no hipocampo. Por outro lado, o padrão de expressão de Grin2C mostrou uma tendência a aumentar nas quatro estruturas, a qual foi mais evidente no cerebelo com um aumento significativo nos níveis de expressão. O padrão de expressão do Grin2D foi também caracterizado por uma tendência para uma diminuição nos níveis de expressão pela vida adulta. Essa tendência foi mais evidente no cerebelo e no hipocampo. Expressões de Grin3A e Grin3B não demonstraram uma tendência específica. No caso de Grin3B, níveis semelhantes de expressão foram observados com a exceção de um pico de expressão no cerebelo de ratos de 10 dias. Os dados obtidos nesse estudo permitiram-nos introduzir novos aspectos na área de expressão de GluRs e poderão contribuir para desvendar potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias mais efetivas para muitas doenças. / Glutamate (Glu) is the most abundant excitatory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in cerebral functions such as learning/memory, development, and cerebral aging. The changes in vulnerability of neurons during postnatal development can be partially explained by changes in expression of glutamate receptors subunits (GluRs). In this work, we aimed to determine expression profile of ionotropic Nmethil- D-aspartate (NMDA) GluR subunits in four brain structures (cortex, cerebellum, striatum and hippocampus) in different stages of postnatal rat development by relative quantification real-time PCR using glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) as endogenous control. Significant changes in Grin1 expression were demonstrated in almost each age from all structures in relation to the initial postnatal expression level. Levels of expression of Grin2A were lower in cerebellum with a gradual raising pattern and high levels in adulthood in cortex and hippocampus. Grin2B expression levels were found to show a decreasing pattern in cerebellum as well as in hippocampus. Conversely, Grin2C expression pattern was found to show an increasing tendency in all four brain structures being more evident in cerebellum with significantly high expression levels. Expression profile of Grin2D was also characterized by a tendency to a drop in expression levels throughout adulthood. This tendency was well defined mainly in cerebellum and in hippocampus. Grin3A and Grin3B expression were found to show a non specific tendency. In the case of Grin3B, even levels of expression were seen with a marked exception of a peak in expression in cerebellum of 10-days old rats. Data generated in this study brings new insight in the field of GluRs expression and might contribute to unmask potential targets for the development of more effective therapies for many disorders.

O glutamato (Glu) é o neurotransmissor excitatório mais abundante do sistema nervoso central e está envolvido em funções cerebrais como aprendizado/memória, desenvolvimento e envelhecimento cerebral. Mudanças na vulnerabilidade neuronal durante o desenvolvimento pós-natal podem ser parcialmente explicadas por mudanças na expressão das subunidades de receptores de Glu (GluRs). O objetivo desse trabalho foi determinar o padrão de expressão das subunidades de GluRs do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) em quatro estruturas cerebrais (cerebelo, córtex, estriato e hipocampo) em diferentes estágios do desenvolvimento pós-natal de ratos por quantificação relativa por PCR em tempo real. Mudanças significativas na expressão de Grin1 foram observadas em quase todas as estruturas em relação aos níveis pós-natais de expressão. Níveis de expressão de Grin2A foram menores no cerebelo com um padrão de aumento gradual e níveis elevados na vida adulta no córtex e no hipocampo. A expressão do Grin2B demonstrou um padrão decrescente no cerebelo assim como no hipocampo. Por outro lado, o padrão de expressão de Grin2C mostrou uma tendência a aumentar nas quatro estruturas, a qual foi mais evidente no cerebelo com um aumento significativo nos níveis de expressão. O padrão de expressão do Grin2D foi também caracterizado por uma tendência para uma diminuição nos níveis de expressão pela vida adulta. Essa tendência foi mais evidente no cerebelo e no hipocampo. Expressões de Grin3A e Grin3B não demonstraram uma tendência específica. No caso de Grin3B, níveis semelhantes de expressão foram observados com a exceção de um pico de expressão no cerebelo de ratos de 10 dias. Os dados obtidos nesse estudo permitiram-nos introduzir novos aspectos na área de expressão de GluRs e poderão contribuir para desvendar potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias mais efetivas para muitas doenças. / Glutamate (Glu) is the most abundant excitatory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in cerebral functions such as learning/memory, development, and cerebral aging. The changes in vulnerability of neurons during postnatal development can be partially explained by changes in expression of glutamate receptors subunits (GluRs). In this work, we aimed to determine expression profile of ionotropic Nmethil- D-aspartate (NMDA) GluR subunits in four brain structures (cortex, cerebellum, striatum and hippocampus) in different stages of postnatal rat development by relative quantification real-time PCR using glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) as endogenous control. Significant changes in Grin1 expression were demonstrated in almost each age from all structures in relation to the initial postnatal expression level. Levels of expression of Grin2A were lower in cerebellum with a gradual raising pattern and high levels in adulthood in cortex and hippocampus. Grin2B expression levels were found to show a decreasing pattern in cerebellum as well as in hippocampus. Conversely, Grin2C expression pattern was found to show an increasing tendency in all four brain structures being more evident in cerebellum with significantly high expression levels. Expression profile of Grin2D was also characterized by a tendency to a drop in expression levels throughout adulthood. This tendency was well defined mainly in cerebellum and in hippocampus. Grin3A and Grin3B expression were found to show a non specific tendency. In the case of Grin3B, even levels of expression were seen with a marked exception of a peak in expression in cerebellum of 10-days old rats. Data generated in this study brings new insight in the field of GluRs expression and might contribute to unmask potential targets for the development of more effective therapies for many disorders.

O glutamato (Glu) é o neurotransmissor excitatório mais abundante do sistema nervoso central e está envolvido em funções cerebrais como aprendizado/memória, desenvolvimento e envelhecimento cerebral. Mudanças na vulnerabilidade neuronal durante o desenvolvimento pós-natal podem ser parcialmente explicadas por mudanças na expressão das subunidades de receptores de Glu (GluRs). O objetivo desse trabalho foi determinar o padrão de expressão das subunidades de GluRs do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) em quatro estruturas cerebrais (cerebelo, córtex, estriato e hipocampo) em diferentes estágios do desenvolvimento pós-natal de ratos por quantificação relativa por PCR em tempo real. Mudanças significativas na expressão de Grin1 foram observadas em quase todas as estruturas em relação aos níveis pós-natais de expressão. Níveis de expressão de Grin2A foram menores no cerebelo com um padrão de aumento gradual e níveis elevados na vida adulta no córtex e no hipocampo. A expressão do Grin2B demonstrou um padrão decrescente no cerebelo assim como no hipocampo. Por outro lado, o padrão de expressão de Grin2C mostrou uma tendência a aumentar nas quatro estruturas, a qual foi mais evidente no cerebelo com um aumento significativo nos níveis de expressão. O padrão de expressão do Grin2D foi também caracterizado por uma tendência para uma diminuição nos níveis de expressão pela vida adulta. Essa tendência foi mais evidente no cerebelo e no hipocampo. Expressões de Grin3A e Grin3B não demonstraram uma tendência específica. No caso de Grin3B, níveis semelhantes de expressão foram observados com a exceção de um pico de expressão no cerebelo de ratos de 10 dias. Os dados obtidos nesse estudo permitiram-nos introduzir novos aspectos na área de expressão de GluRs e poderão contribuir para desvendar potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias mais efetivas para muitas doenças. / Glutamate (Glu) is the most abundant excitatory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in cerebral functions such as learning/memory, development, and cerebral aging. The changes in vulnerability of neurons during postnatal development can be partially explained by changes in expression of glutamate receptors subunits (GluRs). In this work, we aimed to determine expression profile of ionotropic Nmethil- D-aspartate (NMDA) GluR subunits in four brain structures (cortex, cerebellum, striatum and hippocampus) in different stages of postnatal rat development by relative quantification real-time PCR using glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) as endogenous control. Significant changes in Grin1 expression were demonstrated in almost each age from all structures in relation to the initial postnatal expression level. Levels of expression of Grin2A were lower in cerebellum with a gradual raising pattern and high levels in adulthood in cortex and hippocampus. Grin2B expression levels were found to show a decreasing pattern in cerebellum as well as in hippocampus. Conversely, Grin2C expression pattern was found to show an increasing tendency in all four brain structures being more evident in cerebellum with significantly high expression levels. Expression profile of Grin2D was also characterized by a tendency to a drop in expression levels throughout adulthood. This tendency was well defined mainly in cerebellum and in hippocampus. Grin3A and Grin3B expression were found to show a non specific tendency. In the case of Grin3B, even levels of expression were seen with a marked exception of a peak in expression in cerebellum of 10-days old rats. Data generated in this study brings new insight in the field of GluRs expression and might contribute to unmask potential targets for the development of more effective therapies for many disorders.

Orientador: José Roberto Sartori / Resumo: O objetivo da pesquisa foi avaliar o efeito de inclusões de betaína em substituição parcial à metionina no desempenho, parâmetros bioquímicos sanguíneos, fisiológicos, imunológicos, temperatura superficial e comportamento de frangos de corte submetidos a estresse por densidade de alojamento e estresse térmico cíclico. No primeiro experimento foram utilizados 1.736 pintainhos de corte machos distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x2, sendo quatro dietas e duas densidades de alojamento (13 e 18 aves/m²) com sete repetições. No segundo experimento foram utilizados 224 pintainhos de corte machos distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x2, sendo quatro dietas e dois ambientes (termoneutro e estresse cíclico por calor), com sete repetições.As dietas consistiram em: dieta controle positivo (CP, com teores de metionina digestível de 0,511, 0,459, 0,431 e 0404% para as fases pré-inicial, inicial, crescimento e final, respectivamente) e três dietas controle negativo (CN) com teores de metionina digestível 20% menores e suplementadas com os seguintes níveis de betaína HCl 95%: 0,101, 0,090, 0,085 e 0,080%(CN1); 0,300, 0,200, 0,150 e 0,150%(CN2); 0,450, 0,300, 0,225 e 0,225%(CN3), nas fases pré-inicial, inicial, crescimento e final, respectivamente. No primeiro experimento observou-se que a suplementação de betaína melhorou o rendimento de peito, e em alta densidade de alojamento reduziu níveis de colesterol, ácido ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T05:45:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanfolin_Marcos_M.pdf: 6400539 bytes, checksum: e787c4a70d5cec9642157c31383c9565 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Recentemente, o composto BAY 41-2272, um derivado da pirazolopiridina, 5-ciclopropil-2-[ 1-(2-fluor-benzil)-IH-pirazol[3, 4-b]piridina-3-il]-pirimidina-4-ilamina, (Bayer AGGermany), foi descrito como ativador específico de GCs de ação NO-independente (STRAUB et. al., 2001; STASCH et. aI., 2001). Experimentos in vitro demonstraram uma potente ativação da GCs pelo BAY 41-2272 nas concentrações de 0.1 nM a 100 J.IM, sendo esta estimulação potencializada na presença de doador de NO (DEA)/NO 1 J.LM (STACH et. al., 2001). Em estudos utilizando enzimas desprovidas de grupamento heme, o BAY 41-2272 não foi capaz de ativá-Ias demonstrando que seu mecanismo, apesar de ser NO-independente, é heme-dependente (STACH e1.al., 2001). Diante do exposto, observa-se que a inibição da síntese de óxido nítrico é responsável, em grande parte, pelo surgimento de processos patológicos, principalmente para o sistema cardiocirculatório. Neste sentido, o presente estudo foi realizado para investigar, principalmente, o efeito de um recente e potente estimulador da GCs (BAY 41-2272, Bayer AG, Germany) - independente de NO na hipertensão e miocardiopatia em ratos, avaliando desta forma a importância dessa via de estimulação na presença da patologia. Foram utilizados no experimento ratos WistarlUni S.P.F., pesando entre 250 a 350g fornecidos do Centro Multidisciplinar para investigação Biológica da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB - Unicamp). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, dentro de estantes ventiladas (ALESCO), sob condições controladas de luminosidade (12/12 horas) e temperatura (22°C). A técnica iniciou-se por intermédio da implantação de uma unidade transdutor/transmissor na aorta descendente, fixado na parede abdominal interna do animal. As gaiolas com os animais foram colocadas em cima de receivers individuais, ligados a um computador no qual registrava a medição da pressão arterial e a freqüência cardíaca dos animais, por um período de 90 segundos, duas vezes por semana. A aquisição desses dados foi realizada de modo contínuo por meio do sistema de telemetria (Data Science Inc., S1.Paul, MN, USA). Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais, pesados semanalmente e tratados por oito semanas consecutivas. O grupo Controle (n= 10) recebeu (Iml de DMSO, Dimetil Sulfóxido) por gavagem esofágica; o grupo L-NAME (n=20) recebeu L-NAME (n-nitro-L-arginina-metil-éster), recebeu (20mg/rato/dia); o grupo L-NAME + BAY (n=15)recebeu L-NAME(20mg/rato/dia)+ BAY(lOmg/kg/dia)e o GrupoBAY 41-2272 (n=15)recebeu BAY41-2272(10mg/kg/dia). o L-NAME foi dissolvido em água autoclavada e fornecido normalmente para os animais, e o BAY 41-2272 foi administrado através de gavagem oral diária dissolvido em DMSO 80%. Os resultados demonstraram que o BAY 41-2272 diminui significativamente a hipertensão arterial induzida pelo tratamento crônico com L-NAME, diminui o peso cardíaco, diminui o peso do ventrículo esquerdo e reduz a área de lesão dos cardiomiócitos, e que somente os animais do grupo BAY 41-2272 apresentaram um aumento na freqüência cardíaca que pode ser caracterizado por um mecanismo compensatório devido à queda da pressão arterial nos animais / Abstract: Recently, the compound BAY 41-2272, a pyirazolopyridine derivative, was described as an specific GCs activator by a mechanism that is independent of NO (Straub et al. ,2001; Stasch et al., 2001). In vitro experiments demonstrated that BAY 41-2272 stimulates potently sGC at concentrations of 0.1 nM to 100 Nrn, this effeet is potentiated in the presence of NO donors licke 2-(N, N-diethylamino )-diazendate-2-oxide (DEA)/NO (Staeh et. al., 2001). In studies using enzymes were the harm group was removed, BAY 41-2272 did not activate the harm-free enzyme demonstrating that BAY 41-2272 aetives sGC by an NO-independent, but heme-dependent mechanism (Stach et al., 2001). It is observed that the inhibition of the synthesis of nitric oxide is responsible, largely, for the appearance of pathological processes, mainly in the cardiac system. In this sense, this research seeks mainly to investigate the effects of BAY 41-2272 (BAY 41-2272, Bayer AG-Germany, a potent NO-independent stimulator of sGC) in rats, in a physiologie point of view and in a process physiopathological process (hypertension), evaluating the importance of this stimulation way in the presence of the pathology. For this purpose, WistarlUni S.P.F.(250 to 350g) obtained from the Center of Bioterism of the State University of Campinas (CEMIB - UNlCAMP), were housed in individual cages and kept in ventilated shelves (ALESCO) under controlled conditions of light (l2h light dark eycle) and temperature (22°C). The mean arterial blood pressures (MABP) were collected during 90 seconds two times a week for eight weeks. Rats were equipped with implantable radiotelemetry, and a data acquisition system (Data Science Inc., St. Paul, MN, USA), comprising a chronically implantable transducer/transmitter unit fluid-filled catheter. The transmitter was implanted into the peritoneal cavity and the descending aorta, affixed to the inner peritoneal wall. The animals were divided in four experimental groups as follow: 1) Control receiving 1 ml of DMSO 80% per day; 2) L-NAME, receiving L-NAME, alone (20mg/rat per day), 3) BAY 41-2272, reeeiving alone (lOmglkg per day); 4) L-NAME + BAY 41-2272, receiving concomitantly L-NAME (20mg/rat per day) and BAY 41-2272 (10mglkg per day). L-NAME was dissolved in the drinking autoclavated water daily drunk by the rats, BAY 41-2272 was dissolved in 80% of DMSO and administered by gavages. The experiments were performed for up to 8 weeks. The results obtained showed that BAY 41-2272 reduces significantly the arterial hypertension induced by chronic treatment with L-NAME, as well the weight ofthe heart and of the left ventricle and the cardiomyocite injured area. Only animals had receiving BAY 41-2272 showed an increase in the heart rate that can be characterized by a compensatory mechanism in function of reduction of the arterial pressure in these animals / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Os gliomas são tumores que surgem a partir de células da glia e são considerados os mais comuns do sistema nervoso central. São subdivididos em quatro grupos: astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (grau IV ou GBM). Entre esses, o GBM é o tumor mais agressivo e mais freqüente. Apesar de ser encontrado em qualquer faixa etária, esse tumor é raro em crianças. Atualmente a cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ) tem sido utilizado como protocolo de tratamento padrão para a maioria dos pacientes e mesmo assim a sobrevida se mantem extremamente baixa. Além disso, grande parte dos pacientes não respondem ao tratamento com TMZ indicando a necessidade de agentes quimioterápicos alternativos. A zebularina (ZB) é um agente inibidor de DNA metiltransferases (iDNMTs) estável, pouco tóxico, que promove radiosensibilização e tem mostrado efeitos promissores em diversos tipos de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito dos efeitos da ZB em glioblastoma. Os objetivos deste trabalho foram analisar a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT em 5 amostras de substâncias brancas (SB), 6 linhagens de GBM e 33 amostras de gliomas (13 grau I, 2 grau II e 18 grau IV), correlacionar a expressão desses genes com os diferentes graus de gliomas e analisar os efeitos da ZB combinada ou não com TMZ em linhagens de GBM irradiadas e não irradiadas. Para análise da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo Real. Os ensaios de proliferação celular, clonogênico, radiação e apoptose foram realizados em 3 linhagens de GBM (U251, SF188 e T98G) e uma de fibroblastos (MRC5). Também foi realizado o ensaio de proliferação celular em 5 culturas primárias de GBM tratadas com zebularina. Os genes DNMT3A e MGMT mostraram expressão maior nas amostras de SB comparando-se com gliomas e linhagens de GBM. O gene DNMT3B foi mais expresso nas linhagens de GBM comparando-se com as SB. O gene DNMT1 não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas. Os ensaios de proliferação celular mostraram diminuição na proliferação com doses a partir de 50-100µM de ZB e de 250-500µM de TMZ nas linhagens e a partir de 50µM de ZB para as culturas primárias de GBM. As combinações de ZB com TMZ não mostraram sinergia na grande maioria das doses testadas. A ZB aumenta a apoptose nas 3 linhagens com doses a partir de 100µM. A ZB e TMZ mostraram diminuição na formação de colônias com as doses de 100µM e 10µM nas linhagens U251 e SF188 não irradiadas e irradiadas com 2, 4 e 6 Gy. A linhagem T98G expressa o gene MGMT, mostrou resistência a 10µM de TMZ e respondeu ao tratamento com 100µM de ZB. Também foi observado que 10µM de TMZ é mais citotóxico do que 100µM de ZB em fibroblastos não irradiados e irradiados (2Gy). Os resultados obtidos neste estudo mostram que a ZB pode representar um alvo terapêutico interessante para o estudo em glioblastoma. / Gliomas arise from glial cells and are the most common central nervous system tumors. They are divided in four groups: pilocytic astrocytoma (grade I), difuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and glioblastoma (grade IV or GBM). GBM is the most frequent and aggressive glioma. This type of tumor can occur in any age but its rare in children. Actually, surgery, radiotherapy and temozolomide (TMZ) adjuvant/concomitant chemotherapy has been the standard treatment protocol but the survival is extremely poor. In addition most patients do not respond to TMZ indicating the need for alternative chemotherapeutic agents. Zebularine (ZB) is a DNA metiltransferase inhibitor (DNMTi) stable, slight toxic that has been showed promise effects in cancer including radiosensitivity but little is known about ZB in glioblastoma. The objectives of this study were analyze DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT gene expression profile in 5 samples of normal brain, 6 GBM cell lines and 33 glioma samples (13 grade I, 2 grade II e 18 grade IV), correlate with different gliomas grades and analyze the effects of ZB isolate and in combination with TMZ in irradiated and non irradiated GBM cell lines. Gene expression assays was made using Real Time PCR. Proliferation, clonogenic, radiation and apoptosis assays were realized in three GBM cell lines (U251, SF88, T98G) and one fibroblast cell line (MRC5). We also made proliferation assays in 5 primary cultures of samples of GMB. MGMT and DNMT3A genes showed higher expression in normal brain compared to gliomas and GBM cell lines. DNMT3B gene showed higher expression in GBM cell lines compared with normal brain and DNMT1 showed no significant differences among samples analyzed. We observed decrease of cell proliferation from 50-100µM of ZB and 250-500µM of TMZ on GBM cell lines and from 50µM of ZB for primary GBM samples. It was not observed synergy in the most combinations doses of ZB and TMZ (Calcusyn software). It was observed that 100µM of ZB and 10µM of TMZ decrease colony formation on U251 and SF188 cell lines non irradiated and irradiated with 2, 4, and 6Gy. T98G that express MGMT, did not respond to TMZ but showed response to ZB. It was also observed that 10µM of TMZ is more cytotoxic than 100µM of ZB in fibroblast cell line non irradiated and irradiated with 2Gy. ZB increase apoptosis from 100µM on the three GBM cell lines. Results obtained in this study can indicate that ZB may be an interestig therapeutic target for future studies in glioblastoma.

Os gliomas são tumores que surgem a partir de células da glia e são considerados os mais comuns do sistema nervoso central. São subdivididos em quatro grupos: astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (grau IV ou GBM). Entre esses, o GBM é o tumor mais agressivo e mais freqüente. Apesar de ser encontrado em qualquer faixa etária, esse tumor é raro em crianças. Atualmente a cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ) tem sido utilizado como protocolo de tratamento padrão para a maioria dos pacientes e mesmo assim a sobrevida se mantem extremamente baixa. Além disso, grande parte dos pacientes não respondem ao tratamento com TMZ indicando a necessidade de agentes quimioterápicos alternativos. A zebularina (ZB) é um agente inibidor de DNA metiltransferases (iDNMTs) estável, pouco tóxico, que promove radiosensibilização e tem mostrado efeitos promissores em diversos tipos de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito dos efeitos da ZB em glioblastoma. Os objetivos deste trabalho foram analisar a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT em 5 amostras de substâncias brancas (SB), 6 linhagens de GBM e 33 amostras de gliomas (13 grau I, 2 grau II e 18 grau IV), correlacionar a expressão desses genes com os diferentes graus de gliomas e analisar os efeitos da ZB combinada ou não com TMZ em linhagens de GBM irradiadas e não irradiadas. Para análise da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo Real. Os ensaios de proliferação celular, clonogênico, radiação e apoptose foram realizados em 3 linhagens de GBM (U251, SF188 e T98G) e uma de fibroblastos (MRC5). Também foi realizado o ensaio de proliferação celular em 5 culturas primárias de GBM tratadas com zebularina. Os genes DNMT3A e MGMT mostraram expressão maior nas amostras de SB comparando-se com gliomas e linhagens de GBM. O gene DNMT3B foi mais expresso nas linhagens de GBM comparando-se com as SB. O gene DNMT1 não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas. Os ensaios de proliferação celular mostraram diminuição na proliferação com doses a partir de 50-100µM de ZB e de 250-500µM de TMZ nas linhagens e a partir de 50µM de ZB para as culturas primárias de GBM. As combinações de ZB com TMZ não mostraram sinergia na grande maioria das doses testadas. A ZB aumenta a apoptose nas 3 linhagens com doses a partir de 100µM. A ZB e TMZ mostraram diminuição na formação de colônias com as doses de 100µM e 10µM nas linhagens U251 e SF188 não irradiadas e irradiadas com 2, 4 e 6 Gy. A linhagem T98G expressa o gene MGMT, mostrou resistência a 10µM de TMZ e respondeu ao tratamento com 100µM de ZB. Também foi observado que 10µM de TMZ é mais citotóxico do que 100µM de ZB em fibroblastos não irradiados e irradiados (2Gy). Os resultados obtidos neste estudo mostram que a ZB pode representar um alvo terapêutico interessante para o estudo em glioblastoma. / Gliomas arise from glial cells and are the most common central nervous system tumors. They are divided in four groups: pilocytic astrocytoma (grade I), difuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and glioblastoma (grade IV or GBM). GBM is the most frequent and aggressive glioma. This type of tumor can occur in any age but its rare in children. Actually, surgery, radiotherapy and temozolomide (TMZ) adjuvant/concomitant chemotherapy has been the standard treatment protocol but the survival is extremely poor. In addition most patients do not respond to TMZ indicating the need for alternative chemotherapeutic agents. Zebularine (ZB) is a DNA metiltransferase inhibitor (DNMTi) stable, slight toxic that has been showed promise effects in cancer including radiosensitivity but little is known about ZB in glioblastoma. The objectives of this study were analyze DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT gene expression profile in 5 samples of normal brain, 6 GBM cell lines and 33 glioma samples (13 grade I, 2 grade II e 18 grade IV), correlate with different gliomas grades and analyze the effects of ZB isolate and in combination with TMZ in irradiated and non irradiated GBM cell lines. Gene expression assays was made using Real Time PCR. Proliferation, clonogenic, radiation and apoptosis assays were realized in three GBM cell lines (U251, SF88, T98G) and one fibroblast cell line (MRC5). We also made proliferation assays in 5 primary cultures of samples of GMB. MGMT and DNMT3A genes showed higher expression in normal brain compared to gliomas and GBM cell lines. DNMT3B gene showed higher expression in GBM cell lines compared with normal brain and DNMT1 showed no significant differences among samples analyzed. We observed decrease of cell proliferation from 50-100µM of ZB and 250-500µM of TMZ on GBM cell lines and from 50µM of ZB for primary GBM samples. It was not observed synergy in the most combinations doses of ZB and TMZ (Calcusyn software). It was observed that 100µM of ZB and 10µM of TMZ decrease colony formation on U251 and SF188 cell lines non irradiated and irradiated with 2, 4, and 6Gy. T98G that express MGMT, did not respond to TMZ but showed response to ZB. It was also observed that 10µM of TMZ is more cytotoxic than 100µM of ZB in fibroblast cell line non irradiated and irradiated with 2Gy. ZB increase apoptosis from 100µM on the three GBM cell lines. Results obtained in this study can indicate that ZB may be an interestig therapeutic target for future studies in glioblastoma.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:20:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 285138.pdf: 764341 bytes, checksum: 9418929b331c961d948cf3ff186fed83 (MD5) / O objetivo do presente trabalho foi o de estender e confirmar a ação antinociceptiva do (-)-linalol, bem como do envolvimento do sistema glutamatérgico e dos receptores de potencial transitório (TRP) no seu mecanismo de ação antinociceptivo em camundongos. O (-)-linalol administrado via sistêmica (intraperitoneal ou oral), central (intratecal) ou periférica (intraplantar) inibiu, de maneira dependente da dose, a nocicepção induzida pelo glutamato. Além disso, o (-)-linalol foi capaz de reduzir a nocicepção causada pela injeção intratecal de agonistas iGluRs (NMDA, AMPA e cainato), citocinas pró-inflamatórias (IL-1? e TNF-?) e SP. Entretanto, não preveniu a nocicepção induzida pelo trans-ACPD, agonista mGluR. Por outro lado, o (-)-linalol também inibiu a nocicepção induzida pelo cinamaldeido (CA, agonista TRPA1) e somente uma dose alta de (-)-linalol (200 mg/kg) foi capaz de inibir a nocicepção induzida pela capsaicina (agonista TRPV1). Além disso, o (-)-linalol inibiu a hipernocicepção mecânica, mas não a hipernocicepção térmica (quente), induzida pelo CA (i.pl.). A injeção i.pl. de glutamato induziu nocicepção em animais com deleção gênica TRPA1-/- de maneira equivalente àquela observada em camundongos selvagens, sendo que a nocicepção induzida pelo glutamato em animais TRPA1-/- foi também reduzida pelo (-)-linalol. O MK801 (antagonista de receptores NMDA) foi capaz de inibir a nocicepção induzida pelo CA e, interessantemente, a co-administração de doses sub-efetivas de (-)-linalol e de MK801 promoveram redução significativa da nocicepção induzida pelo CA. Usando a técnica de imagens de Ca+2, observou-se que o (-)-linalol inibiu o aumento da [Ca+2]i induzido pelo agonista TRPA1 (alil isotiocianato) em células CHO transfectadas com TRPA1. Porém, apenas a maior dose inibiu o aumento da [Ca+2]i induzido pela capsaicina em cultura de células CHO transfectadas com TRPV1. Em cultura de neurônios do GRD, a adição de (-)-linalol (500 µM) ao sistema causou um aumento na [Ca+2]i tanto em neurônios sensíveis quanto insensíveis aos agonistas TRPs (mentol, alil isotiocianato e capsaicina). Entretanto, doses menores de (-)-linalol (100 e 250 µM) foram capazes de reduzir o aumento da [Ca+2]i em neurônios do GRD induzido pelo AITC, sendo que esta resposta não foi bloqueada pela infusão de MK801. O (-)-linalol (500 µM) também foi capaz de reduzir o aumento da [Ca+2]i induzido pelo glutamato em cultura de neurônios do corno dorsal da medula espinhal. É importante mencionar que o (-)-linalol foi também efetivo em modelos de dor crônica. Assim, o (-)-linalol foi capaz de reduzir a hipersensibilidade mecânica e térmica (frio), bem como o edema de pata, induzida pelo CFA. Contudo, o (-)-linalol não foi capaz de reduzir a hipersensibilidade mecânica induzida pelo CFA em animais TRPA1-/-, sugerindo que o efeito do (-)-linalol na hipersensibilidade mecânica parece envolver os canais TRPA1. Na neuropatia induzida pela ligação parcial do nervo ciático, o (-)-linalol também foi eficiente em atenuar a hipersensibilidade mecânica. Portanto, o presente trabalho estende os dados descritos na literatura e demonstra que o (-)-linalol é eficaz em vários modelos de dor aguda e crônica, sendo, então, uma molécula interessante para o desenvolvimento de fármacos terapêuticamente úteis no controle de estados de dor, principalmente estados de dor crônica. / The objective of the present work was to extend and confirm the antinociceptive action of (-)-linalool, as well the involvement of glutamatergic system and transient receptor potential (TRP) channels in the mechanism (s) underlying the antinociceptive action of (-)-linalool. (-)-Linalool administered by systemic, central or peripheral routes inhibited, dose-dependent, the nociception induced by glutamate and the nociception induced by intrathecal injection of iGluRs agonists (NMDA, AMPA and kainate), pro-inflammatory cytokines (IL-1? e TNF-?) and SP. This compound also inhibited the nociception induced by cinnamaldehyde (CA, TRPA1 agonist) and only the highest dose of (-)-linalool (200 mg/kg) was able to inhibit the nociception induced by capsaicin (TRPV1 agonist). Moreover, (-)-linalool inhibited the mechanical hypersensitivity, but it did not reduce the thermal hypersensitivity, induced by CA (i.pl.). MK801 (NMDA antagonist) was able to inhibit the nociception induced by CA and, interestingly, sub-effectives doses of (-)-linalool co-administered with MK801 promoted significant reduction of CA-induced nociception. We observed that (-)-linalool inhibited the [Ca+2]i increase induced by TRPA1 agonist (AITC, allyl isothiocyanate) in CHO cells. In DRG neurons, (-)-linalool inhibited the [Ca+2]i increase by AITC, not being blocked by MK801. Also, (-)-linalool was able to reduces [Ca+2]i increased induced by glutamate in cultured dorsal horn neurons. It is important to mention that (-)-linalool was effective in pain chronic models. Therefore, (-)-linalool was able to reduce mechanical and thermal (cold) hypersensitivity induced by both CFA and nerve injury, but did not reduce the mechanical hypersensitivity induced by CFA in TRPA1-/-. So, this study adds information about the antinociceptive action of (-)-linalool and indicates that (-)-linalool might be potentially interesting in the development of new clinically relevant drugs for the management of persistent pain.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-23T13:57:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 243424.pdf: 1240520 bytes, checksum: 3b288558382f6a4199b323f0be477200 (MD5)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-23T14:59:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 238067.pdf: 1031962 bytes, checksum: c221ab5663b373401930264fc5e8a508 (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar o tipo de morte celular no hipocampo e córtex cerebral induzida pela administração de AQ em camundongos, bem como avaliar os efeitos do pré-condicionamento com NMDA sobre a expressão da caspase-3, fragmentação de DNA e sobre o sistema antioxidante da glutationa. Os camundongos foram tratados com NMDA (75mg/kg, 10ml/kg i.p) 24 h antes da infusão de AQ (4µl, 9.2mM i.c.v.). O AQ não promoveu fragmentação do DNA tanto no córtex cerebral como no hipocampo, sugerindo morte celular por necrose. O PC com NMDA não promoveu alteração na fragmentação do DNA, demonstrando que não possui efeito neurotóxico. O PC com NMDA e a infusão de AQ não promoveram alterações na expressão da pró-caspase-3 e da caspase-3. O PC com NMDA e a infusão de AQ não alteraram o conteúdo de glutationa total, e a atividade das enzimas glutationa redutase e da glicose 6-fosfato desidrogenase. Contudo, um aumento na atividade da glutationa S-transferase foi observado no córtex após o tratamento com NMDA e AQ. Além disso, o PC com NMDA preveniu a diminuição na atividade da glutationa peroxidase induzida pelo AQ no hipocampo, mas não teve efeito sobre a diminuição da atividade da GPx cortical.