INTRODUÇÃO: A hanseníase é uma doença infectocontagiosa granulomatosa crônica, causada por Mycobacterium leprae e representa ainda um problema de saúde pública no Brasil. Em média 30-40% dos doentes tem risco de desenvolver reações hansênicas, que são considerados estados de exacerbação da resposta imunológica do hospedeiro a antígenos M. leprae. Está bem descrita a importância de células T reguladoras (Tregs) em infecções bacterianas crônicas. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram aumento da proporção de Tregs in situ e em sangue periférico de pacientes multibacilares (mas não em paucibacilares), assim como diminuição da proporção de Tregs na reação tipo 2 (porém não na reação tipo 1), sugerindo a participação deste subtipo celular na imunopatogênese da hanseníase. Entretanto, a baixa frequência de Tregs tem dificultado o estudo da sua capacidade funcional. OBJETIVO: Estabelecer protocolo de expansão de Tregs funcionais em pacientes com hanseníase e, posteriormente, avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas. METODOLOGIA: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram separadas e cultivadas, com anti-CD3 e anti-CD28, acrescidos de IL-2 e rapamicina, por 21 dias. Para avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas, realizou-se um ensaio de co-cultivo das Tregs expandidas e PBMCs autólogas (marcadas com CFSE). Utilizou-se diferentes proporções de Tregs:PBMCs (1:1, 1:2 e 1:5). A casuística foi composta por 29 indivíduos diagnosticados com hanseníase, divididos em quatro grupos, de acordo com a classificação de Ridley e Jopling. Além disso, coletou-se material de 6 indivíduos saudáveis, com a finalidade de caracterizar o pool celular do protocolo de expansão. Para isso, culturas de expansão de indivíduos saudáveis foram submetidas a dois protocolos distintos de purificação celular (beads magnéticas e cell sorting), além de imunofenotipagem das moléculas CD39, PD-1 e LAG3. RESULTADOS: Tregs dos pacientes multibacilar sem reação, nas proporções 1:2 e 1:5, e no grupo reacional tipo 2, na proporção 1:5, mostraram maior capacidade supressora, quando comparados aos grupos pacubacilar sem reação e reacional tipo 2, respectivamente. No grupo de indivíduos saudáveis não houve diferenças na capacidade supressora das Tregs obtidas por separação por beads magnéticas e Tregs obtidas por cell sorting, e não houve expressão significativa de células PD-1+ e LAG-3+ nas culturas de expansão. CONCLUSÃO: Em todos os indivíduos testados, independente da classificação clínica da hanseníase, o protocolo proposto resultou em uma expansão exponencial de uma linhagem de Tregs com atividade supressora, porém com sugestão preliminar de maior eficiência supressora das Tregs na forma MB (com ou sem reação), corroborando a correlação entre atividade supressora de Tregs e maior carga bacilar. Além disso, o protocolo com beads magnéticas se mostrou tão eficaz quanto o protocolo de purificação por cell sorting. A imunofenotipagem das Tregs expandidas de indivíduos saudáveis indicou que não havia número significativo de células exaustas ao fim de nosso protocolo, assim como não houve crescimento concomitante de células T reguladoras do tipo 1 na cultura de expansão / INTRODUCTION: Leprosy is a chronic granulomatous infectious disease caused by Mycobacterium leprae and a public health problem in Brazil. On average, 30-40% of patients are at risk of developing leprosy reactions, which are considered as states of exacerbation of the host\'s immune response to M. leprae antigens. The importance of regulatory T cells (Tregs) in chronic bacterial infections has been well described, but their role in leprosy remains unclear. Previous studies from our group have shown increased proportions of Tregs in situ and in peripheral blood of multibacillary patients (but not in paucibacillary patients), and decrease in the proportion of Tregs in type 2 reaction (but not type 1 reaction), reinforcing the role played by these cells in the immunopathogenesis of leprosy. However, the low numbers of Tregs preclude further studies on their functional capabilities. OBJECTIVE: To establish a protocol for expansion of functional Tregs in patients with leprosy and evaluate the functional capacity of the expanded Tregs. METHOD: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated and cultured under anti-CD3 and anti-CD28 stimulation, plus IL-2 and rapamycin for 21 days. To evaluate the functional capacity of the expanded Tregs, a co-culture assay of the expanded Tregs and autologous PBMCs (labeled with CFSE) was performed. Different ratios of Tregs: PBMCs (1: 1, 1: 2 and 1: 5) were used. The sample consisted of 29 individuals diagnosed with leprosy, divided into four groups, according to the Ridley and Jopling classification. In addition, samples from 6 healthy individuals were collected to characterize better the cellular characteristics of the expansion protocol. For this, cultures of healthy individuals PBMC were submitted to two distinct cell purification protocols (magnetic beads and cell sorting), as well as immunophenotyping of the molecules CD39, PD-1 and LAG3. RESULTS: Expanded Tregs from the multibacillary patients without reaction, at 1:2 and 1:5 ratios, and with type 2 reaction, at 1: 5 ratio, showed greater suppressive capacity that the respective paucibacillary groups. Tregs from healthy individuals obtained through magnetic beads separation and through cell sorting did not show differences in suppressor capacity, and there was no significant expression of PD-1 + and LAG-3 + on cells of the expansion cultures. CONCLUSION: In all individuals tested, irrespective of the leprosy classification, the proposed protocol resulted in an exponential expansion of Tregs with suppressive capacity; however, preliminary evidence indicated stronger suppressor activity of the Tregs from multibacillary patients (with or without reaction), suggesting a direct correlation between Tregs activity and bacillary load in leprosy. In addition, our protocol with magnetic beads proved to be as effective as the cell sorting protocol. Immunophenotyping of expanded Tregs from healthy subjects revealed that there was no significant number of exhausted cells at the end of our protocol, nor there was the concomitant outgrowth of type 1 regulatory T cells in the expansion protocol
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06082019-124326 |
| Date | 16 May 2019 |
| Creators | Lobo, Carolina Cardona Siqueira |
| Contributors | Benard, Gil |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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