FERNANDES, Camila. Aumento da frequência de células T regulatórias CD4+ CD25+ FOXP3 high e com CD8+ CD25+ FOXP3high em pacientes menores de 15 anos com hanseníase multibacilar. 2013. 92 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica ) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-17T15:36:30Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_cfernandes.pdf: 2771950 bytes, checksum: 5cdf0fffe2babc36cf1e1e546cb73d99 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-20T12:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_cfernandes.pdf: 2771950 bytes, checksum: 5cdf0fffe2babc36cf1e1e546cb73d99 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T12:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_cfernandes.pdf: 2771950 bytes, checksum: 5cdf0fffe2babc36cf1e1e546cb73d99 (MD5) Previous issue date: 2013 / Leprosy is a chronic disease caused by Mycobacterium leprae, which represents an important health problem worldwide, especially in Ceará, Brazil. The incidence in under-15-year-olds reflects the endemicity of the region and the difficulty in its control. The disease presents a wide spectrum of clinical manifestations that reflects the immune response developed, with Th1 and Th2 responses related to the paucibacillary and multibacillary (MB) forms, respectively. Regulatory T cells(Tregs) cells have received special attention in the literature and have been associated with development of chronic infections, however its role in leprosy in children under-15-years-old has not yet been elucidated. This study aimed to evaluate the frequency of CD4+CD25+FOXP3high, CD8+CD25+FOXP3high, CD4+CD25highFOXP3+ and CD8+CD25highFOXP3+ Treg cells in patients with leprosy and household contacts(HHC), both under 15 years. Peripheral blood mononucelares cells were cultured for 72 hours with activators(anti-CD3 and anti-CD28) and/or with M.leprae total sonicated. After culture, Treg cells were identified by flow cytometry. We found a greater frequency of CD4+CD25+FOXP3high cells in patients than in HHC, where there were no differences in the other cell populations evaluated. The multibacillary patients had a higher frequency of CD4+CD25+FOXP3high and CD8+CD25+FOXP3high cells compared to HHC. Only these patients, CD4+CD25+FOXP3high cells were negatively correlated with CD4+ and CD8+ non-Treg lymphocytes , and CD8+CD25+FOXP3high cells with CD4+ non-Treg lymphocytes. The greater frequency of Tregs with high expression of FOXP3 in individuals with multibacillary leprosy under-15-years-old and its inverse correlation with the frequency of non-regulatory lymphocytes in these patients suggests the involvement of these cells in the perpetuation of M. leprae infection. / A hanseníase é uma doença crônica causada pelo Mycobacterium leprae, que representa um importante problema de saúde pública mundial, especialmente no estado do Ceará, Brasil. A incidência nos menores de 15 anos de idade reflete a endemicidade da região e a dificuldade no seu controle. A doença apresenta um espectro variado de manifestações clínicas que está relacionado a resposta imune desenvolvida pelo indivíduo, com as respostas Th1 e Th2 relacionadas com as formas paucibacilar e multibacilar, respectivamente. Células T regulatórias (Tregs) têm recebido atenção especial na literatura e têm sido relacionadas com o desenvolvimento de infecções crônicas, entretanto seu papel na hanseníase nos menores de 15 anos ainda não foi elucidado. Esse trabalho teve por objetivo avaliar a freqüência das Tregs CD4+CD25+FOXP3high, CD8+CD25+FOXP3high, CD4+CD25highFOXP3+ e CD8+CD25highFOXP3+ em pacientes com hanseníase e contatos intradomiciliares, ambos menores de 15 anos. Células mononucelares de sangue periférico foram cultivadas por 72 horas com ativadores (anti-CD3 e anti-CD28) e/ou com M.leprae total sonicado. Após cultura, a frequência das Tregs foi identificada por citometria de fluxo. Observamos maior freqüência de células CD4+CD25+FOXP3high em pacientes do que em contatos,não havendo diferenças entre eles com relação às outras populações avaliadas. Os pacientes multibacilares apresentaram maior freqüência de células CD4+CD25+FOXP3high e CD8+CD25+FOXP3high do que os contatos. Apenas nesses pacientes, as células CD4+CD25+FOXP3high foram negativamente correlacionadas com linfócitos CD4+ e CD8+ não-regulatórios e as células CD8+CD25+FOXP3high com linfócitos CD4+ não-regulatórios. A maior frequência de Tregs com elevada expressão de FOXP3 nos menores de 15 anos com hanseníase multibacilar, bem como sua correlação inversa com a frequência de linfócitos não regulatórios nesses pacientes sugere a participação dessas células na perpetuação da infecção pelo M. leprae.

FERNANDES, C. A depleção de células TREGS agrava a mucosite intestinal experimental induzida por irinotecano. 2017. 126 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, 2017. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-11-10T17:00:35Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfernandes.pdf: 6243807 bytes, checksum: 40210c70777a4901e7b5e2c7df59e10d (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-11-13T10:37:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfernandes.pdf: 6243807 bytes, checksum: 40210c70777a4901e7b5e2c7df59e10d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-13T10:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfernandes.pdf: 6243807 bytes, checksum: 40210c70777a4901e7b5e2c7df59e10d (MD5) Previous issue date: 2017-09-13 / Intestinal mucositis (IM) is a common side effect related to anti-cancer chemotherapy based on irinotecan. MI is characterized by severe diarrhea and significantly affects patients' quality of life, increasing morbidity and health costs. Up to 80% of irinotecan-treated patients develop some degree of MI. The pathophysiology of this side effect is not fully understood and, unfortunately, there is no specific and effective treatment. The investigation of pathophysiological mechanisms may potentially guide the discovery of biomarkers or new therapeutic strategies. Previous studies point to the involvement of inflammatory molecules and cells, such as nitric oxide, COX-2, KC (analogous to human IL-8), TNF-α, IL-1, IL-18 and IL-33, toll-like receptors and neutrophils in the pathogenesis of MI in murine models. However, the participation of other innate and adaptive immune system cells, regulated in part by these cytokines, has not been investigated yet. Aim: To identify the expression profile of Tregs, Th7, Th (non-reg and non-Th17 cells) and type 3 innate lymphoid cells along the development of irinotecan-induced IM and to evaluate the role of Tregs in the pathogenesis. Methods: C57BL/6 (20-25g) received saline or irinotecan (75 mg/kg, i.p.), once daily/4 days, for induction of MI. Euthanasia occurred on days 1 (D1), D3, D5 or D7. For depletion of the Tregs the mice were pretreated with cyclophosphamide (100 mg/kg), 2h before the first dose of irinotecan, and euthanized on D7. Lymphocytes from intestinal lamina propria were isolated by enzymatic digestion and percoll gradient and splenic cells by mechanical digestion. The frequency of different lymphocyte subpopulations was identified by flow cytometry. On the day of euthanasia, a peripheral blood sample was collected for blood leukocyte count (x 103/l) and ileum samples for MPO, cytokine and histopathological assay. Results: The mice with MI had weight loss (P<0.05), leucopenia (P<0.05), diarrhea (P <0.05), intestinal damage (P<0.05) and reduction of villus/crypt ratio (P<0.05). In addition, irinotecan injection induced the increase of the % of Tregs (P<0.05) and % of Th17 cells (P<0.05), intestinal and splenic. The ratio of intestinal %Treg / Th17 correlated positively with severity parameters, such as diarrhea (P<0.05) and histopathological (P<0.05) scores of mice. There was a negative correlation between % Treg / Th17 splenic and these same parameters (P<0.05). Tregs depletion aggravated MI, increasing weight loss (P<0.05), diarrhea scores (P<0.05), mortality (100%) and reducing villus/crypt ratio (P<0, 05). The number of intestinal neutrophils increased after irinotecan injection, with the peak on D5 (P<0.05). In D7, there was a reduction in the number of these cells vs D5 (P<0.05). In addition, there was a negative correlation between the number of neutrophils and the % of Tregs (P<0.05). The frequency of type 3 innate lymphoid cells (P<0.05) and other Th cells, non-Treg and non-Th17 cells (P<0.05), decreased after irinotecan injection and were positively modulated after Tregs depletion. In addition, irinotecan injection elevated TNF-, IL-1, KC and IL-17A cytokines in the gut (P<0.05). With Tregs depletion, the levels of KC (P <0.05) and TNF- (P<0.05) were potentialized, and there was a reduction of IL-10 (P<0.05). Conclusion: Tregs cells are important to counterbalancing inflammation in irinotecan induced-IM. / A mucosite intestinal (MI) é um efeito colateral comum relacionado à quimioterapia anti-câncer baseada em irinotecano. MI cursa com diarreia intensa e afeta de forma significativa a qualidade de vida dos pacientes, aumentando a morbidade e os custos com a saúde. Cerca de até 80% dos pacientes tratados com irinotecano desenvolvem algum grau de MI. A fisiopatologia deste efeito colateral não está completamente esclarecida e, infelizmente, não há um tratamento específico e efetivo. A investigação de mecanismos fisiopatológicos pode potencialmente guiar a descoberta de biomarcadores ou novas estratégias terapêuticas. Estudos anteriores apontam para o envolvimento de moléculas e células inflamatórias, tais como: óxido nítrico, COX-2, KC (análoga à IL-8 humana), TNF-α, IL1-, IL-18 e IL-33, receptores semelhantes a toll e neutrófilos na patogênese da MI em modelos murinos. Entretanto, a participação de outras células do sistema imune inato e adaptativo, reguladas em parte por estas citocinas, ainda não foi investigada. Objetivo: Traçar o perfil de expressão das células Tregs, Th7, Th (não-reg e não-Th17) e linfoides inatas do tipo 3 ao longo do desenvolvimento da MI induzida por irinotecano e avaliar o papel das Tregs na patogênese. Métodos: C57BL/6 (20-25g) receberam salina ou irinotecano (75 mg/kg, i.p.), uma vez ao dia/4 dias, para indução da MI. A eutanásia ocorreu nos dias 1(D1), D3, D5 ou D7. Para depleção das Tregs os animais foram pré-tratados com ciclofosfamida (100mg/kg), 2h antes da primeira dose de irinotecano e eutanasiados no D7. Os linfócitos da lâmina própria foram isolados por digestão enzimática e gradiente de percoll e as células esplênicas por digestão mecânica. A frequência das diferentes subpopulações linfocitárias foi identificada por citometria de fluxo. No dia da eutanásia coletou-se amostra de sangue periférico para contagem de leucócitos sangúíneos (x103/l) e amostras de íleo para ensaio de MPO, dosagem de citocinas e histopatológico. Resultados: A MI cursou com perda ponderal (P<0,05), leucopenia (P<0,05), diarreia (P<0,05), lesão intestinal (P<0,05) e redução da razão vilo/cripta (P<0,05). Adicionalmente, a injeção de irinotecano induziu o aumento do %Tregs (P<0,05) e %Th17 (P<0,05), intestinais e esplênicas. A razão entre % Treg/Th17 intestinal correlacionou-se positivamente com parâmetros de gravidade, como os escores de diarreia (P<0,05) e histopatológicos (P<0,05) dos animais. Houve uma correlação negativa entre %Treg/Th17 esplênico e esses mesmos parâmetros (P<0,05). A depleção de Tregs agravou a MI, aumentando a perda ponderal (P<0,05), os escores de diarreia (P<0,05), a mortalidade (100%) e reduzindo a razão vilo/cripta (P<0,05). O número de neutrófilos intestinais aumentou após injeção de irinotecano, com pico no D5 (P<0,05). No D7, houve uma redução no número dessas células vs D5 (P<0,05). Além disso, houve uma correlação negativa entre o número de neutrófilos e o %Tregs (P<0,05). A frequência de células linfoides inatas do tipo 3 (P<0,05) e de outras células Th, não-Treg e não-Th17 (P<0,05), diminuiu após a injeção de irinotecano, sendo moduladas positivamente após a depleção de Tregs. Além disso, a injeção de irinotecano elevou as citocinas TNF-, IL-1, KC e IL-17A no intestino dos animais (P<0,05). Com a depleção das Tregs, os níveis de KC (P<0,05) e TNF-P<0,05) foram potencializados, além de ocorrer uma redução de IL-10 (P<0,05). Conclusão: As células Tregs são importantes para contrabalancear a inflamação na MI induzida por irinotecano.

REZENDE, Daniela Ventin Prates. Estudo da expressão imunohistoquímica de linfócitos T-REG em pacientes com formas polares de hanseníase e reações hansênicas. 2013. 75 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-04T15:03:32Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvprezende.pdf: 2239058 bytes, checksum: 2dbb8f8181af72d0a4856cfaee6a4dc3 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-04T15:03:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvprezende.pdf: 2239058 bytes, checksum: 2dbb8f8181af72d0a4856cfaee6a4dc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-04T15:03:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvprezende.pdf: 2239058 bytes, checksum: 2dbb8f8181af72d0a4856cfaee6a4dc3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae and presents a wide range of clinical manifestations, depending on the host immune response. At the tuberculoid pole, patients have an effective Th1 cellular immune response against bacillus, with well-demarcated granulomas, which limits the disease, while the lepromatous pole is characterized by the absence of specific cellular immunity against Mycobacterium leprae, with a Th2 immune response, uncontrolled proliferation of leprosy bacilli and a spread disease. In addition to Th1 and Th2 lymphocytes, recently other subset of T cells has been described. T regulatory lymphocytes play an immunosuppressive role in the activity of other cells and seem to participate in modulating the immune response in human chronic infections and self-tolerance. We performed immunohistochemical study on skin biopsies of 35 patients with different forms of leprosy using anti-CD4, anti-CD8 and anti-FoxP3 antibodies. There was an increased CD4 expression in tuberculoid patients and an increased CD8 expression in lepromatous patients. The FoxP3 expression was higher in lepromatous and reversal leprosy reaction patients. As previously demonstrated in other granulomatous infections, T regulatory cells may play a role in the immunopathology of leprosy. However, studies with larger series of patients are required to further elucidate the relationship between the presence of these cells and the clinical form of the disease. / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae e apresenta uma grande variedade de manifestações clínicas que dependem da resposta imunológica do hospedeiro. Em um polo está a forma tuberculoide, na qual os pacientes apresentam uma resposta imunológica Th1 celular contra o bacilo, com formação de granulomas bem delimitados com doença localizada. No outro polo temos a forma virchowiana caracterizada pela ausência de imunidade celular específica ao Mycobacterium leprae, com padrão de resposta imunológica Th2, com macrófagos repletos de bacilos, mas com poucos linfócitos, sem formação de granulomas e com disseminação da doença. Além dos linfócitos Th1 e Th2, outra população de linfócitos T foi descrita recentemente. Os linfócitos T regulatórios desempenham um papel imunossupressor na atividade de outros linfócitos e de outras células inflamatórias e parecem participar da modulação da resposta imunológica em infecções crônicas em seres humanos e da autotolerância. Neste trabalho, foram analisadas 35 biópsias cutâneas de lesão de pacientes portadores de diferentes formas de hanseníase quanto à expressão dos marcadores celulares CD4, CD8 e FoxP3 por imunohistoquímica. Enquanto a expressão do CD4 foi maior nos pacientes portadores da forma tuberculoide da hanseníase, a expressão do CD8 mostrou-se maior nos portadores de hanseníase virchowiana. Quanto à expressão do FoxP3, esta foi maior nos portadores da forma virchowiana da hanseníase e da reação hansênica tipo 1 em relação aos indivíduos sadios. Parece que, assim como já demonstrado em outras doenças infecciosas granulomatosas, os linfócitos Treg participam da imunopatologia da hanseníase. Entretanto, estudos com maior número de pacientes são necessários, para um melhor entendimento da relação entre a presença desses linfócitos e a forma clínica da doença.

Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O linfoma de Hodgkin classico (LHc) e a neoplasia linfoide mais comum em adultos jovens. Trata-se de doenca curavel em 75% dos casos, porem 25% dos pacientes vao apresentar doenca refrataria ou recidivada com pior evolucao. Diferente de todas as neoplasias humanas, as celulas malignas do LHc, denominadas Reed-Sternberg (RS), compoe 1 a 5% de toda a massa tumoral, sendo o restante composto por celulas inflamatorias normais. As celulas de RS perpetuam-se em meio a este microambiente devido a incapacidade do sistema imune em reconhece-las e combate-las. Linfocitos T reguladores (LTR) sao moduladores importantes do microambiente em doencas linfoproliferativas e tem a capacidade de limitar a funcao dos linfocitos T efetores (LTE). Ja foi descrito que, no microambiente tumoral, os LTR estao aumentados e os LTE diminuidos. Mas o comportamento destas celulas no sangue periferico de pacientes com neoplasias ainda nao esta bem explicado. Portanto, compreender qual o papel do desequilibrio imunologico no LHc e crucial para o desenvolvimento de novos fatores prognosticos e alvos terapeuticos. Objetivos: Quantificar os LTR e LTE no sangue periferico e microambiente de pacientes com LHc. Correlacionar a presenca dos LTR e LTE no microambiente tumoral com o sangue periferico. Correlacionar a presenca do EBV nas celulas RS com a quantificacao destas subpopulacoes de linfocitos T. Avaliar a importancia da presenca do EBV, dos LTR e LTE na resposta ao tratamento dos pacientes com LHc. Avaliar o impacto do tratamento na quantificacao de linfocitos T reguladores e TH17 de pacientes com LHc. Casuistica e Metodo: Foram recrutados para este estudo, prospectivamente, 60 pacientes diagnosticados com LHc entre marco de 2009 e marco de 2013 em dois servicos de Hematologia distintos da cidade de São Paulo. Foram incluidos, tambem, 19 controles saudaveis recrutados no banco de sangue do Hemocentro da UNIFESP apos serem aprovados para doacao. A quantificacao de LTR e LTE foi avaliada por citometria de fluxo utilizando os anticorpos CD3, CD4, CD25, FOXP3, GITR e IL17 e por imunoistoquimica utilizando o anticorpo FOXP3. Resultados: A quantificacao de celulas T CD4+FOXP3+ e CD4+GITR+ foi maior em pacientes que nos controles (36,92 u 23,5%; p=0,009 e 39,63 - 14,3%; p<0,0001 respectivamente). O tratamento do LHc reduz a quantificacao de linfocitos T CD4+GITR+ (19,44 - 16,8%; p=0,036). A contagem de linfocitos T CD4+FOXP3+, CD4+CD25highFOXP3+ e CD4+IL17+ e maior nos pacientes que nos controles (32,1 u 24,24%; p=0,009, 31,28 u 21,79%; p=0,037, 32,9 - 18,71%; p=0,002 e 33,00 u 18,53; p=0,001, respectivamente). Os pacientes com sintomas B apresentaram quantificacao de linfocitos CD4+FOXP3+ no microambiente maior (p=0,032). Conclusoes: Houve correlacao positiva e significante entre a quantificacao de LTR circulante e no microambiente e o estadiamento avancado da doenca e entre a quantificacao de LTR e LTE circulantes nos pacientes e nos controles. Nao houve correlacao da quantificacao de LTR e LTE no sangue periferico ou no microambiente com a presenca do virus EBV nas celulas de RS ou entre a quantificacao de LTR e LTE em sangue periferico e a quantificacao de LTR no microambiente tumoral dos pacientes estudados. O tratamento quimio e radioterapico diminuiu a quantificacao de LTR e LTE circulantes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 larissa_fontes_ioc_mest_2016.pdf: 4617034 bytes, checksum: eee0cf93cb18ec86d4b978b114c27212 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS \2013 \201CWiskott-Aldrich Syndrome\201D) é uma imunodeficiência primária associada a infecções recorrentes e ao desenvolvimento de doenças autoimunes e linfomas. Essa imunodeficiência se desenvolve em consequência de mutações no gene que codifica a proteína WASP (\201CWAS Protein\201D), expressa em células hematopoiéticas, e com funções reguladoras sobre os rearranjos do citoesqueleto de actina e na ativação de linfócitos T. Nesse sentido, camundongos deficientes em Wasp (Wasp \201Cknockout\201D \2013 WKO) apresentam desregulação de processos centrais para a resposta imunológica, resultando em migração leucocitária aberrante, proliferação linfocitária deficiente, e disfunção de células T reguladoras (Treg). De forma interessante, foi demonstrado que as células Treg, definidas pelo fenótipo CD4+CD25+Foxp3+ e com função imunossupressora, já se encontram em menor número no timo desses animais. Esse dado sugere que a deficiência em Wasp resulta em defeito na geração intratímica de células Treg. Nesse contexto, é importante salientar que a migração do timócito através do microambiente tímico é crucial para a formação das células T e, particularmente, a matriz extracelular exerce uma função determinante para os eventos de adesão e de-adesão da célula migrante. Assim, podemos postular que a matriz extracelular medeia interações cruciais para as células Treg tímicas (tTreg), fornecendo e facilitando o acesso aos diferentes sinais celulares durante o processo de maturação dessas células Nesse projeto, decidimos estudar a participação de ligantes e receptores da matriz extracelular na maturação de células tTreg e o possível envolvimento dessas moléculas na deficiência numérica de células tTreg em camundongos WKO. Foi observada uma diminuição da rede de fibronectina na região medular do timo dos animais WKO em relação ao controle. Além disso, observamos uma redução de células tTreg expressando VLA-4 e VLA-5 nos animais WKO em relação ao controle. As análises de proliferação, ativação e morte demonstraram que as células Treg de animais WKO apresentam alterações em relação às células precursoras (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). De forma interessante, as análises de adesão em fibronectina demonstraram que as células Treg dos animais WKO apresentam menos filopódios que as células Treg do controle, e que essa diminuição é proeminente comparando-se às células T CD4 SP. Esses resultados sugerem que a fibronectina tenha importância na diferenciação das células tTreg / Abstract: The Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) is a primary immunodeficiency associated with recurrent infection and development of autoimmune diseases and lymphomas. This immune deficiency develops as a result of mutations in the gene encoding the WASP protein ("WAS protein"), expressed in hematopoietic cells, and with regulatory functions on the actin cytoskeleton rearrangements and activation of T lymphocytes. Accordingly, mice deficient in Wasp (Wasp "knockout" - WKO) present disruption in central processes to the immune response, resulting in aberrant leukocyte migration, impaired lymphocyte proliferation and dysfunction of regulatory T cells (Treg). Interestingly, it was shown that Treg cells defined by the CD4+CD25+Foxp3+ phenotype and immunosuppressive function, already decreased in the thymus of the animals. This suggests that the Wasp deficiency results in defective intrathymic generation of Treg cells. In this context, it is important to note that the migration of the thymocyte through the thymic microenvironment is crucial for the formation of T cells and, particularly, the extracellular matrix has a decisive role in the events of adhesion and de-adhesion of migrant cell Thus, we postulated that the extracellular matrix mediates interactions crucial for thymic Treg cells (tTreg) by providing and facilitating access to different cellular signals during the maturation process of these cells. In this project, we decided to study the role of ligands and receptors of extracellular matrix in the maturation of tTreg cells and the possible involvement of these molecules in numerical deficiency tTreg WKO cells in mice. We observed a decrease in fibronectin network in the medulla of the thymus of WKO animals compared to the control. In addition, a decrease in cells expressing VLA-4 and VLA-5 in WKO animals compared to the control. The analysis of proliferation, activation, and death demonstrated that Treg cells animals in WKO showed changes from precursor cells (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). Interestingly, adhesion on fibronectin showed that Treg cells from WKO animals present less filopodia compared to control Treg cells and that this is a marked decrease as compared to the CD4 SP cells. These results suggest an important role for fibronectin in the differentiation of Treg cells

Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-02T20:16:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Raphaela Silva Leandro Santos.pdf: 2858553 bytes, checksum: fed89296295c51fb6999d3c552b880f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-03T21:59:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Raphaela Silva Leandro Santos.pdf: 2858553 bytes, checksum: fed89296295c51fb6999d3c552b880f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Raphaela Silva Leandro Santos.pdf: 2858553 bytes, checksum: fed89296295c51fb6999d3c552b880f5 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Introdução: Pouco se sabe sobre o papel modulador exercido pelos linfócitos T reguladores (Treg) e pelas diferentes citocinas envolvidas no desenvolvimento e manutenção dos cistos radiculares (CR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar a imuno-expressão dos marcadores CD4, CD25, interleucina-10 (IL-10), interleucina -17 (IL-17) e forkhead box P3 (FoxP3) em CR e associar esses achados com características histológicas dessas lesões. Métodos: Cinquenta e cinco espécimes teciduais de CR foram analisados quanto às suas características histológicas e submetidos à análise imuno-histoquímica utilizando os anticorpos anti-CD4, anti-CD25, anti IL-10, anti-IL-17 and anti-FoxP3. Os resultados da imunoexpressão foram correlacionados com a intensidade do infiltrado inflamatório e a espessura do revestimento epitelial cístico. Resultados: Todos os casos apresentaram marcação positiva para todos os marcadores estudados, mas com intensidades de expressão diferentes. A expressão de CD4, CD25, IL-10 e FoxP3 foi considerada fraca para todos os casos avaliados, enquanto que a IL-17 apresentou expressão forte e foi observada tanto nas células inflamatórias quanto no revestimento epitelial. Não foi observada diferença estatisticamente significante entre os marcadores avaliados e a intensidade do infiltrado inflamatório e a espessura do revestimento epitelial. Foi observada correlação positiva as marcações de IL-17 e FoxP3. Conclusão: Os presentes resultados evidenciaram uma participação menos expressiva de células Treg em cistos radiculares, através da fraca expressão de CD4, CD25, IL-10 e FoxP3, em detrimento de uma presença mais significativa de IL-17. / Introduction: Little is known about T regulatory (Treg) lymphocytes and cytokines modulation in development and maintenance of radicular cysts (RC). In this perspective, the aim of this study was to evaluate immunoexpression of the markers CD4, CD25, interleukin-17 (IL-17) and interleukin-10 (IL-10) and forkhead box P3 (FoxP3) in RC and to correlate these findings with the histological features of these lesions. Methods: Fifty five RC tissue specimens were analyzed for their histological characteristics and submitted to immunohistochemical analysis using anti-CD4, anti-CD25, anti IL-10, anti-IL-17 and anti-FoxP3 antibodies. The results of immunoexpression were correlated with the intensity of the inflammatory infiltrate and thickness of the epithelial lining. Results: All cases were positive to all studied markers, but with different expression intensity. The immunoexpression of CD4, CD25, IL-10 and FoxP3 was weak for all evaluated cases, whereas IL-17 exhibited strong expression in all cases. In addition, IL-17 was expressed in both inflammatory and epithelial cells of cystic lining. No significant differences in the number of positive cells were observed in terms of the intensity of the inflammatory infiltrate or epithelial thickness. It was observed positive correlations between the immunoexpressions of IL- 17 and FoxP3. Conclusion: The present results showed a less expressive participation of Treg cells in radicular cysts due to weak expression of CD4, CD25, IL-10 and FoxP3 in detriment to a more significant presence of IL-17.

O controle de respostas imunes patológicas (autoimunidade, alergia, rejeição de transplantes) tem sido um dos principais objetivos dos imunologistas. Apesar dos avanços recentes, a maioria dos tratamentos atuais ainda procura diminuir a imunidade e inflamação em vez de restabelecer o estado saudável da tolerância imunológica. Sepse é uma doença desencadeada pela presença de bactérias e/ou produtos bacterianos como lipopolissacarídeos (LPS), componente principal da membrana externa de bactérias gram-negativas, ativando a resposta imune do hospedeiro. A caracterização do perfil de linfócitos na resposta à tolerância ao LPS são de extrema importância para a contribuição do estudo da imunodepressão na sepse. O objetivo deste estudo foi investigar se a comprovada redução de mortalidade previamente vista em modelo de sepse animal através tolerância ao LPS, pode ser associada com o aumento da população de linfócitos T CD4+ regulatórios e Th17. Camundongos machos C57/6, receberam por via subcutânea ( s.c.) injecções de LPS ( 1mg/kg ) durante 5 dias , seguido por perfuração e ligadura cecal (CLP ) . Citocinas e linfócitos marcados foram medidos durante, após a tolerância e o desafio CLP. Ambos os subtipos de células T analisados Treg e Th17 , mostrou aumento destas células no baço durante e após a tolerância. Este estudo demonstrou que a mortalidade reduzida depois de tolerância previamente constatada pode ser associada com o aumento da população de células T regulatórias e Th17 devido a imunorregulação do hiperinflamação e recrutamento de neutrófilos / The control of pathological immune responses (autoimmunity, allergy, transplant rejection) has been a major goal of immunologists. Despite recent advances, most current treatments still seeks to reduce immunity and inflammation rather than restore the healthy state of immune tolerance. Sepsis is a disease triggered by the presence of bacteria and / or bacterial products like lipopolysaccharide (LPS), the main component of the outer membrane of gram-negative bacteria, activating the immune response of the host. The characterization of lymphocyte profile in response to LPS tolerance is extremely important for the study of immunosuppression in sepsis contribution. The aim of this study was to investigate whether the proven reduction in mortality seen previously in animal sepsis model by tolerance to LPS, can be associated with the increase in population of CD4 + regulatory and Th17. Mice C57 / 6 mice received subcutaneous (s.c.) injection of LPS (1mg / kg) for 5 days, followed by cecal ligation and puncture (CLP). Cytokines and marked lymphocytes were measured during after tolerance and CLP challenge. Both subtypes of T cells Treg and Th17 analyzed showed an increase of these cells in the spleen during and after tolerance. This study demonstrated that reduced mortality after previously seen tolerance may be associated with increasing the population of regulatory T cells and Th17 because immunoregulation of the hiperinflamação and neutrophil recruitment