Imunização terapêutica utilizando células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) pulsadas com antígenos de HIV constitui um meio promissor de potencializar a resposta imune específica anti-HIV em pacientes infectados. Neste contexto, é importante ressaltar que células dendríticas além de estimular a resposta imune específica, podem ser capazes de promover a tolerância periférica em linfócitos T CD4+ e T CD8+ ao induzir deleção, anergia ou através da expansão de células T reguladoras (T regs). Experimentos in vitro foram conduzidos para avaliar a capacidade de MoDCs pulsadas com HIV autólogo inativado em induzir apoptose celular, respostas celulares específicas e a geração de T regs. Os pacientes avaliados neste estudo foram indivíduos infectados pelo HIV, sem uso de tratamento antirretroviral (n = 14) com número de células T CD4+ acima de 350 células/L. MoDCs foram geradas a partir de células mononucleares de sangue periférico e em seguida foram pulsadas com vírus autólogo inativado por Aldrithiol-2, tratadas com estímulo para maturação e então cultivadas com linfócitos autólogos. A apoptose de linfócitos T e MoDCs e a frequência de células efetoras e reguladoras foram avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostraram que não houve diferença nos níveis de apoptose de células T CD4+, T CD8+ ou MoDCs entre os grupos pulsadas e não pulsadas com HIV inativado. Foi observado que tanto MoDCs pulsadas quanto aquelas não pulsadas com o vírus autólogo inativado foram capazes de induzir células T CD4+ secretoras de IFN-, enquanto que apenas MoDCs pulsadas levou a um aumento no percentual de células T CD8+ efetoras. Pacientes com contagem de células T CD4+ acima de 500 células/L apresentaram um percentual maior de células T CD4+ secretoras de IFN após estimulo de MoDCs pulsadas. Esta diferença não foi observada em células T CD8 +. T regs também foram induzidas in vitro após cocultivo com MoDCs. Níveis basais mais elevados de T regs foram encontrados em pacientes com carga viral plasmática baixa. Em conjunto, os resultados indicam que MoDCs pulsadas com HIV-1 são capazes de induzir linfócitos T efetores, mas também aumentam a frequência de T regs in vitro. Além disto, pacientes com maior contagem de células T CD4 + foram capazes de responder de forma mais eficiente ao estímulo com MoDCs pulsadas. Viremia persistente na infecção crônica pelo HIV pode estar associada significativamente à perda de T reg / Therapeutic immunization using inactivated autologous HIVpulsed dendritic cells (DCs) is a promising strategy to enhance specific anti-HIV immune responses in infected patients. In this context, it is important to note that DC besides stimulate a specific immune response, may be able to promote tolerance in peripheral CD4 + and CD8 + T cells inducing deletion, anergy or through expansion of regulatory T cells (T reg). In vitro experiments were conducted to evaluate the capacity of autologous HIVstimulated DC to induce apoptosis, effector cellular T cell responses and T reg generation. For these purposes, we used peripheral blood from HAARTnaïve HIVinfected patients (n=14) with CD4+ T cell counts above 350 cell/L for generation of monocytederived DC (MoDC). MoDC were pulsed with aldrithiol-2 (AT-2)-inactivated autologous virus and matured. MoDC were then cocultured with autologous lymphocytes and the apoptosis, production of IFN- and T reg cell frequency were evaluated by flow cytometry. There was no difference in the rate of apoptosis of CD4, CD8 T cells or MoDC between the groups pulsed and not pulsed with inactivated HIV. MoDC pulsed or not with inactivated autologous virus induced IFN- +CD4+ T cells, whereas only pulsed MoDC were able to increase effector CD8+ T cells percentage along the time culture. Patients with CD4+ T cell counts above 500 had an increased percentage of CD4 + T cells secreting IFN- upon DC pulsed with HIV. This difference was not observed in CD8 + T cells. Interestingly, T reg were also induced in vitro after MoDC cocultivation. Higher baseline T reg counts were found in patients with lower plasma viral loads. These results show that MoDC pulsed with HIV-1 are able to induce effector lymphocyte but also elevate the frequency of T reg in vitro. Patients with higher CD4+ T cell counts are able to respond more efficiently to the stimulation with pulsed MoDC, and persistent viremia in chronic HIV infection is associated with significant loss of T reg

A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) é a imunodeficiência primária sintomática mais comum em adultos. Pacientes ICV frequentemente apresentam diversas alterações de linfócitos B, número reduzido de células Treg e ativação imune crônica, bem como infecções recorrentes, alta incidência de doenças autoimunes e um risco aumentado de doenças malignas. Testamos a hipótese de que a frequência de células B10 estaria diminuída nos pacientes ICV, já que elas desempenham um importante papel no desenvolvimento de células Treg, no controle da ativação de células T e na autoimunidade. Para tanto, nós avaliamos a frequência de células B10 em pacientes ICV buscando correlacioná-la com as diferentes manifestações clínicas e imunológicas associadas à doença. Quarenta e dois (42) pacientes com diagnóstico de ICV e 17 indivíduos saudáveis foram convidados a participar do estudo. A partir das CMSP criopreservadas foram realizados testes de perfil de ativação celular, presença de células T reguladoras (Treg) e caracterização das células B10. Os níveis de sCD14 no plasma foram determinados por ELISA. A produção de IL-10 foi determinada por ELISA em sobrenadante de cultura de células B. Pacientes ICV apresentam frequência diminuída de células B CD24hiCD38hi produtoras de IL-10 em diferentes condições de cultura celular e frequência diminuída de células B CD24hiCD27+ em cultura celular estimulada por CpG+PIB. No entanto, a produção de IL-10 por células B não demonstrou diferença significativa entre pacientes ICV e controles. A frequência de células B10 não teve correlação com a presença de autoimunidade, ativação celular ou frequência de células Treg em pacientes ICV. Este trabalho sugere que pacientes ICV têm um comprometimento na subpopulação de células B reguladoras, mas que não está correlacionado com as características clínicas e imunológicas apresentadas por esses indivíduos / Common variable immunodeficiency (CVID) is the most prevalent symptomatic primary immunodeficiency in adults. CVID patients often present changes in the frequency and function of B lymphocytes, reduced number of Treg cells, chronic immune activation, recurrent infections, high incidence of autoimmunity and increased risk for malignancies. We hypothesized that the frequency of B10 cells would be diminished in CVID patients because these cells play an important role in the development of Treg cells and in the control of T cell activation and autoimmunity. Therefore, we evaluated the frequency of B10 cells in CVID patients and correlated it with the different clinical and immunological characteristics of this disease. Forty-two CVID patients and 17 healthy controls were recruited for this study. Cryopreserved PBMCs were used for analysis of T cell activation, frequency of Treg cells and characterization of B10 cells by flow cytometry. Plasma sCD14 levels were determined by ELISA. IL-10 production was determined in supernatant by ELISA after culture of B cells. We found that CVID patients presented a decreased frequency of IL-10-producing CD24hiCD38hi B cells in different cell culture conditions and decreased frequency of IL-10-producing CD24hiCD27+ B cells stimulated with CpG+PIB. However, the B cells secretion of IL-10 was similar between CVID patients and healthy controls. The frequency of B10 cells had no correlation with autoimmunity, immune activation and Treg cells in CVID patients. This work suggests that CVID patients have a compromised regulatory B cell compartment which is not correlated with clinical and immunological characteristics presented by these individuals

O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation

Há dados na literatura indicando que as células que saem do timo com o fenótipo CD4+CD25+ são desenvolvidas continuamente como uma linhagem independente e possuem um papel importante no processo de regulação da resposta imune. Essas células são chamadas células T reguladoras naturais. Várias questões sobre estas células permanecem em aberto, como por exemplo, como elas são geradas, o que é determinante na sua atividade reguladora e que marcadores específicos podem ser usados para identificá-las? Dentro deste contexto, o nosso objetivo neste trabalho foi identificar no timo e em timócitos CD4+/CD25+ humanos, novas moléculas potencialmente importantes no desenvolvimento e/ou na atividade supressora das células T reguladoras naturais. Para este objetivo, utilizamos a abordagem de phage display, com uma biblioteca de fagos de peptídeos, e timos humanos obtidos de pacientes portadores de cardiopatias congênitas, submetidos a cirurgias cardíacas realizadas no InCor. A busca dessas moléculas foi feita, separadamente, em 3 tipos de material biológico: timócitos totais, fragmento do tecido tímico e timócitos CD4+/CD25+. Antes da incubação da biblioteca de fagos com os timócitos totais e timócitos CD4+/CD25+ (separação em FACS), foi realizada uma etapa de preclearing, incubando-se a biblioteca de fagos com um pool de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou timócitos CD4+/CD25-, respectivamente. Os fagos não ligantes, recuperados desta etapa, foram então incubados com as células de interesse. Para o tecido tímico não foi feita etapa de pre-clearing. Os fagos obtidos com os diferentes materiais biológicos foram recuperados em cultura de bactérias e usados em ciclos posteriores de seleção. Após três ciclos de seleção, os fagos foram seqüenciados e identificados quanto à expressão de peptídeos ligantes para timócitos totais, timo e timócitos CD4+/CD25+, e analisados em bancos de dados no BLAST. Os fagos selecionados para validação um ligante de tecido tímico: M2C e um ligante de timócitos CD4+/CD25+: R2A fazem similaridade a duas proteínas associadas ao metabolismo da Vitamina D3, molécula envolvida em imunorregulação e indução de tolerância, em diversos modelos experimentais. Porém, não há dados na literatura a respeito do seu papel em células T reg naturais. Na validação molecular desses fagos, apesar de certa variabilidade entre os diferentes ensaios, verificamos, por ELISA, que os fagos se ligam preferencialmente a 1,25 diidroxivitamina D3, forma ativa da Vitamina D3. Entretanto, nos ensaios de validação funcional, a influência da vitamina D na diferenciação dessas células não foi confirmada de forma consistente, uma vez que só tivemos aumento no número de células CD4+/CD25+, em cultura com Vitamina D, em poucos experimentos. As moléculas identificadas no presente estudo podem ter implicações relevantes no processo de diferenciação e na atividade de células T CD4+CD25+ reguladoras e serão mais investigadas na continuidade deste trabalho. / There are consistent data in literature indicating that thymic CD4+CD25+ cells play an important role in immune regulation and are continuously developed as an independent lineage in the thymus. These cells are known as natural regulatory T cells. Several questions about these cells remain unanswered, such as how they are generated, what is determinant in their regulatory function and which specific molecular markers can be used to identify them. Taking this into consideration, our aim was to identify new potentially important molecules in the development and/or supressive function of natural regulatory T cells, both in the thymus and in CD4+CD25+ thymocytes. For this, the phage display technique was employed, with a peptide phage library and thymic specimens obtained from children who underwent corrective cardiac surgery at the Heart Institute (InCor), in São Paulo. The search for these molecules was separately performed in 3 types of biological material: thymic tissue, thymocytes and CD4+CD25+ thymic cells. In the first stage, the phage peptide-library was incubated with a pool of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). After the incubation, phages bound to PBMC were discarded (pre-clearing). In the second stage, unbound phages were incubated with either total thymocytes or CD4+CD25+ thymic cells. The pre-clearing stage was not perfomed in the thymic tissue. The phages obtained with after incubation with the different biological materials were recovered in E. coli culture and used in additional cycles of selection. After three rounds of selection, the recovered phages from the total thymocytes, from thymic tissue and thymocytes CD4+CD25+ were sequenced and their ligands identified. Among the phages selected for validation one ligand of thymic tissue: M2C and one ligand of CD4+CD25+ thymocytes: R2A present similarity to two proteins associated to the metabolism of Vitamin D3, a molecule involved in imunoregulation and toelrance induction in several experimental models. However, there are no data in the literature concerning the possible role of this moelcule in natural regulatory T cells. In the molecular validation of theses phages, although some variability between the diffeterent assays we have verified by ELISA, that the phages present preferential binding to the 1,25 dhydroxyvitamin D3, the active form of Vitamin D3. However, in the functional validation assays, the influence of the Vitamin D3 in the differentiation of these cells could not be consistently confirmed since we could observe an increase in the number of CD4+CD25+ cells cultured with vitamin D in only a few experiments. The ligand-receptor molecules we have defined in this study may have relevant implications in the development of CD4+CD25+ regulatory T cells in the thymus

O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation

A angiotensina (Ang) II e aldosterona induzem hipertensão arterial por mecanismos em parte mediados pela imunidade adaptativa, envolvendo linfócitos T auxiliares respondedores (Tresp). Os linfócitos T reguladores (Treg) são capazes de suprimir os efeitos próinflamatórios do sistema imune. O presente estudo avaliou se a transferência adotiva de Treg é capaz de prevenir a hipertensão e a lesão vascular induzidas pela Ang II ou pela aldosterona, em dois protocolos distintos. No protocolo com Ang II, camundongos machos C57BL/6 sofreram a injeção endovenosa de Treg ou Tresp, sendo depois infundidos com Ang II (1&#956;g/kg/min), ou salina (grupo controle) por 14 dias. No protocolo com aldosterona, um outro conjunto de animais sofreu injeções de Treg ou Tresp, sendo depois infundido com aldosterona (600&#956;g/kg/d) ou salina (grupo controle), pelo mesmo intervalo de tempo. O grupo tratado com aldosterona recebeu salina 1% na água. Tanto o grupo Ang II como aldosterona apresentaram elevação da pressão arterial sistólica (43% e 31% respectivamente), da atividade da NADPH oxidase na aorta (1,5 e 1,9 vezes, respectivamente) e no coração (1,8 e 2,4 vezes, respectivamente) e uma redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina (de 70% e 56%, respectivamente), quando comparados com os respectivos controles (P<0,05). Adicionalmente, a administração de Ang II proporcionou um aumento rigidez vascular (P<0,001), na expressão de VCAM-1 nas artérias mesentéricas (P<0,05), na infiltração aórtica de macrófagos e linfócitos T (P<0,001) e nos níveis plasmáticos das citocinas inflamatórias interferon (INF)-&#947;, interleucina (IL)-6, Tumor necrosis factor (TNF)-&#945; e IL-10 (P<0,05). Ang II causou uma queda de 43% no número de células Foxp3+ no córtex renal, enquanto que a transferência adotiva de Treg aumentou as células Foxp3+ em duas vezes em comparação com o controle. A administração de Treg preveniu o remodelamento vascular induzido pela aldosterona, observado na relação média/lúmen e na área transversal da média das artérias mesentéricas (P<0,05). Todos os parâmetros acima foram prevenidos com a administração de Treg, mas não de Tresp. Estes resultados demonstram que Treg são capazes de impedir a lesão vascular e a hipertensão mediadas por Ang II ou por aldosterona, em parte através de ações antiinflamatórias. Em conclusão, uma abordagem imuno-modulatória pode prevenir o aumento da pressão arterial, o estresse oxidativo vascular, a inflamação e a disfunção endotelial induzidos por Ang II ou aldosterona. / Angiotensin (Ang) II and aldosterone (aldo) induce hypertension through mechanisms in part mediated by adaptive immunity and T responder lymphocytes. T regulatory (Treg) lymphocytes suppress pro-inflammatory mediators of the immune system. We questioned whether Treg adoptive transfer will blunt Ang II or aldo-induced hypertension and vascular injury, by evaluating two distinct protocols. In the Ang II protocol, male C57BL/6 mice were injected i.v. with Treg or T responder cells, and then infused with Ang II (1&#956;g/kg/min) or saline, for 14 days. In the aldosterone protocol, another set of animals was injected with Treg or T responder cells, and then infused with aldosterone (600&#956;g/kg/d) or saline, for the same period. The aldosterone group received saline 1% in drinking water. Both Ang II and aldosterone treated mice presented an increase in systolic blood pressure (43% and 31% respectively), of NADPH oxidase activity in aorta (1.5 and 1.9 fold, respectively) and heart (1.8 and 2.4 fold respectively) and an impaired vasodilatory response do acetylcholine (by 70% and 56% respectively), when compared to their controls (P<0.05). In addition, Ang II administration resulted in increased vascular stiffness (P<0.001), mesenteric artery vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) expression (P<0.05), aortic macrophage and T cell infiltration (P<0.001), and the plasma levels of the inflammatory cytokines INF-&#947;, IL-6, TNF-&#945;, and IL-10 (P<0,05). AngII caused a 43% decrease in the number of Foxp3+ cells in the renal cortex, while Treg adoptive transfer increased Foxp3+ cells 2-fold compared to control. Treg administration prevented aldosterone-induced vascular remodelling, as observed by media to lumen ratio and media cross sectional area analysis of mesenteric arteries (P<0,05). All the above were prevented by Treg but not by T responder cell adoptive transfer. These results demonstrate that Treg suppress Ang II or aldo-mediated vascular injury and BP elevation, in part through anti-inflammatory actions. These findings suggest that an immunomodulatory approach can prevent Ang II or aldosterone-induced blood pressure elevation, vascular oxidative stress, inflammation and endothelial dysfunction.

Há dados na literatura indicando que as células que saem do timo com o fenótipo CD4+CD25+ são desenvolvidas continuamente como uma linhagem independente e possuem um papel importante no processo de regulação da resposta imune. Essas células são chamadas células T reguladoras naturais. Várias questões sobre estas células permanecem em aberto, como por exemplo, como elas são geradas, o que é determinante na sua atividade reguladora e que marcadores específicos podem ser usados para identificá-las? Dentro deste contexto, o nosso objetivo neste trabalho foi identificar no timo e em timócitos CD4+/CD25+ humanos, novas moléculas potencialmente importantes no desenvolvimento e/ou na atividade supressora das células T reguladoras naturais. Para este objetivo, utilizamos a abordagem de phage display, com uma biblioteca de fagos de peptídeos, e timos humanos obtidos de pacientes portadores de cardiopatias congênitas, submetidos a cirurgias cardíacas realizadas no InCor. A busca dessas moléculas foi feita, separadamente, em 3 tipos de material biológico: timócitos totais, fragmento do tecido tímico e timócitos CD4+/CD25+. Antes da incubação da biblioteca de fagos com os timócitos totais e timócitos CD4+/CD25+ (separação em FACS), foi realizada uma etapa de preclearing, incubando-se a biblioteca de fagos com um pool de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou timócitos CD4+/CD25-, respectivamente. Os fagos não ligantes, recuperados desta etapa, foram então incubados com as células de interesse. Para o tecido tímico não foi feita etapa de pre-clearing. Os fagos obtidos com os diferentes materiais biológicos foram recuperados em cultura de bactérias e usados em ciclos posteriores de seleção. Após três ciclos de seleção, os fagos foram seqüenciados e identificados quanto à expressão de peptídeos ligantes para timócitos totais, timo e timócitos CD4+/CD25+, e analisados em bancos de dados no BLAST. Os fagos selecionados para validação um ligante de tecido tímico: M2C e um ligante de timócitos CD4+/CD25+: R2A fazem similaridade a duas proteínas associadas ao metabolismo da Vitamina D3, molécula envolvida em imunorregulação e indução de tolerância, em diversos modelos experimentais. Porém, não há dados na literatura a respeito do seu papel em células T reg naturais. Na validação molecular desses fagos, apesar de certa variabilidade entre os diferentes ensaios, verificamos, por ELISA, que os fagos se ligam preferencialmente a 1,25 diidroxivitamina D3, forma ativa da Vitamina D3. Entretanto, nos ensaios de validação funcional, a influência da vitamina D na diferenciação dessas células não foi confirmada de forma consistente, uma vez que só tivemos aumento no número de células CD4+/CD25+, em cultura com Vitamina D, em poucos experimentos. As moléculas identificadas no presente estudo podem ter implicações relevantes no processo de diferenciação e na atividade de células T CD4+CD25+ reguladoras e serão mais investigadas na continuidade deste trabalho. / There are consistent data in literature indicating that thymic CD4+CD25+ cells play an important role in immune regulation and are continuously developed as an independent lineage in the thymus. These cells are known as natural regulatory T cells. Several questions about these cells remain unanswered, such as how they are generated, what is determinant in their regulatory function and which specific molecular markers can be used to identify them. Taking this into consideration, our aim was to identify new potentially important molecules in the development and/or supressive function of natural regulatory T cells, both in the thymus and in CD4+CD25+ thymocytes. For this, the phage display technique was employed, with a peptide phage library and thymic specimens obtained from children who underwent corrective cardiac surgery at the Heart Institute (InCor), in São Paulo. The search for these molecules was separately performed in 3 types of biological material: thymic tissue, thymocytes and CD4+CD25+ thymic cells. In the first stage, the phage peptide-library was incubated with a pool of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). After the incubation, phages bound to PBMC were discarded (pre-clearing). In the second stage, unbound phages were incubated with either total thymocytes or CD4+CD25+ thymic cells. The pre-clearing stage was not perfomed in the thymic tissue. The phages obtained with after incubation with the different biological materials were recovered in E. coli culture and used in additional cycles of selection. After three rounds of selection, the recovered phages from the total thymocytes, from thymic tissue and thymocytes CD4+CD25+ were sequenced and their ligands identified. Among the phages selected for validation one ligand of thymic tissue: M2C and one ligand of CD4+CD25+ thymocytes: R2A present similarity to two proteins associated to the metabolism of Vitamin D3, a molecule involved in imunoregulation and toelrance induction in several experimental models. However, there are no data in the literature concerning the possible role of this moelcule in natural regulatory T cells. In the molecular validation of theses phages, although some variability between the diffeterent assays we have verified by ELISA, that the phages present preferential binding to the 1,25 dhydroxyvitamin D3, the active form of Vitamin D3. However, in the functional validation assays, the influence of the Vitamin D3 in the differentiation of these cells could not be consistently confirmed since we could observe an increase in the number of CD4+CD25+ cells cultured with vitamin D in only a few experiments. The ligand-receptor molecules we have defined in this study may have relevant implications in the development of CD4+CD25+ regulatory T cells in the thymus

INTRODUÇÃO: As infecções causadas por bactérias ou vírus são frequentes em pacientes com imunodeficiência comum variável (ICV) devido à deficiência de anticorpos e associação com alteração da função das células T. OBJETIVOS: Avaliar o efeito da ativação de receptores Toll-like (TLR) utilizando ligantes de TLRs em células T monofuncionais ou polifuncionais em pacientes com ICV. MÉTODOS: Foram selecionados 16 pacientes com ICV do Ambulatório de Manifestações Dermatológicas das Imunodeficiências Primárias ADEE3003 HC-FMUSP e 16 controles saudáveis. Os métodos utilizados de citometria de fluxo foram: a) análise em sangue periférico de linfócitos B, linfócitos T quanto ao perfil de ativação/maturação, linfócitos T foliculares (Tfh) e células T reguladoras (Treg); b) dosagem de citocinas e quimiocinas em amostras de soro e em sobrenadante de culturas de células mononucleares do sangue periférico (CMNs) estimuladas com agonistas de TLRs; c) avaliação das células TCD4+ mono e polifuncionais secretoras de IL-17a, IL-22, TNF, IFN- e IL-10, e expressão de marcador de ativação crônica de CD38 estimuladas por agonistas de TLR2, TLR3 e TLR7/8 e estímulos policlonais como enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) e acetato miristato de forbol e ionomicina (PMA/IONO); d) células Th22 e Tc22 estimuladas com TLR e SEB. RESULTADOS: Na ICV, os linfócitos B do sangue periférico mostram diminuída frequência, sendo em maior frequência de linfócitos B naïve (CD19+IgD+CD27-), e ausência de células B de memória. Além disto, um aumento na expressão do marcador de exaustão PD-1 foi observado nas células TCD4+ de memória efetora (CD45RA-CCR7-) e na expressão de CD38, em células TCD8+ terminalmente diferenciadas (CD45RA + CCR7-). Em contraste, houve diminuição na frequência de células T reguladoras naïve nos pacientes com ICV. Nos indivíduos com ICV foi observado aumento na frequência de células TCD4+ TNF+ sob estímulo TLR2 e TLR7/8 comparado ao grupo controle, enquanto que sob estímulo com PMA/IONO houve menor frequência de células TCD4+ e TCD8+ secretoras de IFN-y IL-17a, IL-22 ou TNF. Já em células TCD8+ houve importante redução na ativação via TLR3 na resposta de IL-22, IFN-y e IL-17a. Contudo, os estímulos com TLR7/8 e SEB foram capazes de aumentar a frequência de células Th22 e Tc22 nos pacientes com ICV. Em geral, as células TCD4+, que secretam simultaneamente 4 a 5 citocinas induzidas por TLR foram preservadas em ICV. Embora as células TCD4+ polifuncionais secretoras de 3 citocinas, foram capazes de responder a estímulos via TLR2 e TLR7/8, as células TCD8+ não responderam para qualquer estímulo via TLRs. Além disso, as células T que expressam CD38 mostraram menor polifuncionalidade aos estímulos via TLRs e PMA/IONO. O perfil inflamatório nos pacientes com ICV foi observado pela elevação sérica de IL-6, CCL-2, CCL-5, CXCL8, CXCL-9, CXCL-10. Alteração na resposta aos agonistas de TLRs em ICV pode ser observada com a ativação dos agonistas de TLRs em CMNs, que mostrou maior produção de TNF e diminuição de CCL2 e CXCL8 após ativação via TLR4. Em contraste, o agonista de TLR7/8, teve ação oposta induzindo CXCL10 e reduzindo os níveis de CXCL9. Chama atenção no ICV, à reduzida secreção de IFN-alfa induzida por TLR7/8, que não foi observada com a ativação via TLR9. CONCLUSÕES: Até o momento, os achados em ICV mostram alterações nas células T, seja quanto à baixa frequência de células T reguladoras naïve e a reduzida resposta efetora, em especial das células TCD8+. Contudo, enfatiza o potencial de adjuvante dos agonistas de TLR7/8 na ativação das células T / INTRODUCTION: Infections caused by bacteria or viruses are common in patients with Common Variable Immunodeficiency (CVID), due to antibody deficiency and association with altered function of T cells. OBJECTIVES: To evaluate the effect of Toll-like receptors (TLR) activation using TLR agonists on the monofunctional or polyfunctional T cells in patients with CVID. METHODS: We selected 16 patients with ICV from the Dermatologic Manifestations of Primary Immunodeficiencies Clinic ADEE3003 HC-FMUSP and 16 healthy controls. The methods used for flow cytometry were: a) analysis of peripheral blood B lymphocytes, T lymphocytes were assessed by the activation/maturation profile, follicular T cells (Tfh) and regulatory T cells (Treg); b)evaluation of cytokines and chemokines serum levels and in supernatants of mononuclear cell cultures from peripheral blood (PBMC) stimulated with TLR agonists; c) evaluation of mono and polyfunctional CD4+ T cells secreting IL-17a, IL-22, TNF, IFN-y and IL-10, and expression chronic activation marker of CD38 stimulated by agonists of TLR2, TLR3 and TLR7/8 and polyclonal stimuli such as Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) and phorbol myristate acetate and ionomycin (PMA / IONO); d) analysis of Tc22 and Th22 cells stimulated with TLR and SEB. RESULTS: In the CVID, the peripheral blood B cells show decreased frequency, being higher frequency of naïve B cells (IgD+ CD19+ CD27-) and lack of memory B cells. Moreover, an increased expression of PD-1, an exhaustion marker, was detected in the CD4+ T cell effector memory (CD45RA- CCR7-) and expression of CD38 on CD8+ T terminally differentiated cells (CD45RA+ CCR7-). In contrast, a decreased frequency of naïve regulatory T cells was detected in the patients with CVID. In CVID patients it was observed increased frequency of T CD4+ TNF+ cells upon TLR2 and TLR7/8 agonists compared to the control group, while under stimulation with PMA /IONO there was a lower frequency of CD4+ and CD8+T cells secreting IFN-y, IL-17a, IL-22 or TNF. The CD8+T cells showed a significant reduction of in the IL-22 response, IFN-? and IL-17a induced by TLR3 activation. However, stimulation with TLR7/8 and SEB were able to increase the frequency of Th22 and TC22 cells in the patients with CVID. In CVID patients it was observed increased frequency of T CD4+ TNF+ cells upon TLR2 and TLR7/8 agonists compared to the control group, while under stimulation with PMA /IONO there was a lower frequency of CD4+ and CD8+ T cells secreting IFN-y, IL-17a, IL-22 or TNF. The CD8+ T cells showed a significant reduction of in the IL-22 response, IFN-y and IL-17a induced by TLR3 activation. However, stimulation with TLR7/8 and SEB were able to increase the frequency of Th22 and TC22 cells in the patients with CVID. In general, CD4+ T cells that secrete simultaneously 4 to 5 cytokines induced by TLR were preserved in CVID. Although polyfunctional CD4+ T cells secreting 3 cytokines were able to respond to TLR2 and TLR7/8 agonists, the CD8+ T cells did not respond to any stimuli. In addition, T cells expressing CD38, showed lower polyfunctionality to the stimuli via TLRs and PMA/IONO. Furthermore, the inflammatory status in the patients with CVID was observed by the increased serum levels of IL-6, CCL-2, CCL-5, CXCL8, CXCL-9, CXCL-10. In contrast, the agonist of TLR7/8 had opposite action inducing CXCL10 and reducing the CXCL9 levels. Noteworthy in CVID, that the reduced secretion of IFN-alfa induced by TLR7/8 was not observed with TLR9 activation. CONCLUSIONS: To date, the CVID findings shows alterations in the T cells, as the low frequency of naïve regulatory T cells and reduced effector response, mainly of CD8+ T cells. However, it emphasizes the adjuvant potential of the TLR7/8 agonist in the T cells activation

Na América Central, em países como Honduras, El Salvador, Nicarágua e Costa Rica, tem sido descrito lesões cutâneas não ulceradas, designadas como leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causadas por Leishmania (L.) infantum chagasi. Em Honduras, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica são produzidas pelo mesmo agente etiológico, Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma área geográfica. A LCNU é a forma clínica mais comum, afetando principalmente crianças maiores de 5 anos e adultos jovens. A lesão é definida como uma pápula, nódulo indolor, não ulcerativo, eritematoso ou da cor da pele, na presença ou ausência de halo hipopigmentado. Tendo em vista que existe uma lacuna no conhecimento do padrão de resposta imunológica tecidual da leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, este trabalho visou avaliar a resposta imunológica inflamatória e regulatória in situ das lesões de pele. Foram utilizadas 20 biópsias de pele, com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. O estudo histopatológico foi avaliado em cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e o padrão da resposta imune inflamatória e regulatória por meio da reação de imuno-histoquímica utilizando marcadores para linfócito T (CD4 e CD8), T regulatório (FoxP3), e antígenos intracelulares como: IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 e IFN-y. As alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme e caracterizadas por um infiltrado inflamatório linfohistiocitário de intensidade variável e associado à formação de granulomas epitelioides. Já as alterações histopatológicas identificadas na epiderme mostraram-se mais leves e correspondem a leve adelgaçamento, leve acantose e exocitose focal linfohistiocitária. Em 55% dos casos, o parasitismo mostrou-se discreto. A análise imuno-histoquímica das lesões cutâneas dos pacientes com LCNU mostrou no infiltrado inflamatório a presença de todos os marcadores utilizados neste estudo, em especial de linfócitos T CD8+ e CD4+, e das citocinas inflamatórias IFN-y e IL-6. A participação de células FoxP3+, TGF-beta+ e IL-10+ foi discreta, assim como das células IL-17+. Os dados mostram uma participação maior da resposta inflamatória na leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, capaz de controlar o parasitismo e consequentemente a evolução do tamanho da lesão; porém, embora mais discreta, a resposta imune regulatória pode ser responsável para manter um balanço na resposta imune celular evitando danos teciduais e levando a baixa persistência parasitária no tecido, necessária para a manutenção de uma imunidade protetora e duradoura / Honduras: evaluation of the inflammatory and regulatory immune response in situ in skin lesions [dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. In Central America, in countries such as Honduras, El Salvador, Nicaragua and Costa Rica, non-ulcerated skin lesions, designated as non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis (NUCL) caused by Leishmania (L.) infantum chagasi, has been reported. In Honduras, visceral leishmaniasis and non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis are caused by the same etiologic agent, Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographical area. NUCL is the most common clinical form, affecting mainly children older than 5 years and young adults. The lesion is defined as a papule, painless nodule, non-ulcerative, erythematous or skin color, in the presence or absence of hypopigmented halo. Considering that, there is a gap in the knowledge of the tissue immune response pattern of non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, this study aimed to evaluate the in situ inflammatory and regulatory immune response of skin lesions. Twenty skin biopsies with a confirmed parasitological diagnosis by scraping of lesion stained by Giemsa and observed under an optical microscope were used. The histopathological study was evaluated in histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and the inflammatory and regulatory immune response through the immunohistochemistry reaction using T lymphocyte (CD4 and CD8), regulatory T (FoxP3) markers, and intracellular antigens such as IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 and IFN-y. The most significant histopathological changes were observed in the dermis, and they were characterized by a lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensity and associated to the formation of epithelioid granulomas. On the other hand, the histopathological changes identified in the epidermis were lighter and correspond to mild thinning, mild acanthosis and focal lymphohistiocytic exocytosis. In 55% of the cases, the parasitism was discreet. The immunohistochemistry analysis of the cutaneous lesions of patients with NUCL showed in the inflammatory infiltrate the presence of all the markers used in this study, especially CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and the inflammatory cytokines IFN-y and IL-6. The participation of FoxP3+, TGF-beta+ and IL-10+ cells was discrete, as well as IL-17+ cells. The data show a higher participation of the inflammatory response in non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, able to control the tissue parasitism and consequently the evolution of the lesion size; however, although discreet, the regulatory immune response may be responsible for maintaining a balance in the cellular immune response avoiding tissue damage and leading to low tissue parasitic persistence necessary for the maintenance of a protective and lasting immunity

Orientadores: Alessandro dos Santos Farias, Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T01:58:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pradella_Fernando_M.pdf: 4468527 bytes, checksum: 63d6760bd0ea06c5fcab94d1421da291 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular