A indução de tolerância ao alotransplante, sem auxílio de drogas imunossupressoras é um dos maiores desafios da Imunologia. Considerando o potencial tolerogênico das células dendríticas e a atividade imunorreguladora da Hsp60, objetivamos determinar a capacidade das células dendríticas (DCs) na interação com a Hsp60, de induzir imunorregulação, in vitro, e tolerância ao aloenxerto de pele, no sistema murino. Para tal, geramos três tipos de DCs derivadas de células da medula óssea de camundongos Balb/c: DCs imaturas (iDCs e iDCs IL-10 tratadas com IL-10) e DCs maduras (mDCs). As DCs foram caracterizadas quanto à sua: (i) morfologia, (ii) imunofenótipo, (iii) estabilidade do fenótipo imaturo; (iv) produção espontânea de citocinas; (v) resposta linfocitária alogenéica. Os três tipos de DCs gerados, neste trabalho, (mDCs, iDCs e iDCs IL- 10) apresentaram diferenças imunofenotípicas e funcionais em relação à estimulação de uma resposta proliferativa alogenéica. As mDCs tiveram maior expressão de moléculas coestimuladoras e maior indução de proliferação de linfócitos T (LT) alogenéicos. As iDCs IL-10 apresentaram estabilidade do fenótipo imaturo, após desafio com LPS e mostraram baixa capacidade de induzir proliferação de LT alogenéicos. Não observamos um perfil diferencial em relação à produção espontânea de citocinas pelos três tipos de DCs, no tempo analisado. No entanto, TNF- foi a citocina mais freqüentemente detectada nos 3 tipos de DCs, principalmente nas mDCs, enquanto que a IL-6 foi produzida em maiores quantidades pelas mDCs e a IL-10 pelas iDCs IL-10. Após a caracterização das diferentes DCs, estas células foram tratadas com os fragmentos da Hsp60, por 24 horas. Avaliamos se esses fragmentos tiveram a capacidade de modificar nas DCs: (i) a expressão de moléculas coestimuladoras; (ii) a produção de citocinas; (iii) a capacidade de induzir e inibir proliferação e citocinas em coculturas autólogas; (iv) a capacidade de inibir proliferação e a produção de citocinas em resposta ao estímulo de CD3; (v) a capacidade de induzir tolerância ao transplante de pele em camundongos via injeção de DCs tratadas com fragmentos da Hsp60 ou com a injeção do anticorpo DEC205-N3. A interação dos fragmentos da Hsp60 com as diferentes DCs induziu modificação na expressão de moléculas coestimuladoras e na produção de citocinas. Alguns peptídeos se destacaram como predominantemente indutores de citocinas imunorreguladoras, (IL-10 e TGF-; peptídeos p277 e N7), e outros como predominantemente indutores de citocinas pró-inflamatórias (TNF-, IFN- e IL-12; peptídeos I8 e I2). Além disso, o peptídeo N7 foi o maior inibidor da expressão de moléculas coestimuladoras, enquanto a proteína C-Hsp60 ora aumentou ora inibiu essa expressão. O peptídeo N7 teve um efeito dominante na inibição da auto-reatividade de LT dirigida às DCs, tanto proliferativa como na produção de citocinas, principalmente inflamatórias. Alguns fragmentos da Hsp60 (C-Hsp60, p277 e principalmente o peptídeo N7) foram capazes de, em alguns experimentos, inibir a proliferação e a produção de citocinas inflamatórias das coculturas de LT com DCs estimuladas com o anticorpo CD3. Apesar da dupla atividade funcional da Hsp60 na interação com as DCs observada, in vitro, nesse trabalho, houve um predomínio de imunorregulação. Destacamos que o peptídeo N7 teve o perfil mais imunorregulador. Nossos dados sugerem o envolvimento de múltiplos mecanismos de ação para a atividade imunorreguladora da Hsp60, na interação com as DCs. Apesar dos nossos protocolos não terem induzido tolerância ao aloenxerto de pele em camundongos, observamos que os animais injetados com as iDCs IL-10 tratadas com p277 ou N7, tiveram uma maior sobrevida do enxerto (16 e 17 dias versus 14 dias). Assim, acreditamos que esses protocolos de indução de tolerância possam ser otimizados para o uso em modelos murinos, visando futuras aplicações na clínica em transplantes e doenças auto-imunes. / The induction of tolerance to allotransplant without the help of immunosupressive drugs is one of the major challenges in immunology. Considering the tolerogenic potential of dendritic cells and the immunoregulatory activity of Hsp60, our objective was to determine the capacity of dendritic cells (DCs) of inducing immunoregulation through the interaction with Hsp60, in vitro, and tolerance to the skin allograft, in the murine system. For this, we have generated three types of DCs derived from bone marrow of Balb/c mice: immature DCs (iDCs and IL-10 iDCs treated with IL-10) and mature DCs (mDCs). The DCs were characterized as to their: (i) morphology, (ii) immunophenotype, (iii) immature phenotype stability; (iv) spontaneous cytokine production; (v) induction of allogeneic LT proliferation. The three types of DCs generated in this work (mDCs, iDCs and IL-10 iDCs) have presented immunophenotypic and functional differences in relation to the stimulation of allogeneic proliferative response. The mDCs presented the highest expression of coestimulatory molecules and the strongest induction of allogeneic T lymphocyte proliferation. The IL-10 iDCs presented stability of the immature phenotype after LPS challenge and showed low capacity of inducting allogeneic TL proliferation. We did not observe a differential profile in relation to the spontaneous cytokine production by all three types of DCs in the period analyzed. However, TNF- was the most frequent cytokine detected in the three types of DCs, especially in the mDCs, while IL-6 was mostly produced by mDCs, and IL-10 by IL-10 iDCs. After the characterization of the different DCs, these cells were treated with the fragments of Hsp60 for 24 hours. We evaluated if these fragments had the capacity of modifying in the DCs: (i) the expression of coestimulatory molecules; (ii) the production of cytokines; (iii) the capacity of inducing and inhibiting proliferation and cytokine in autologous cocultures; (iv) the capacity of inhibiting proliferation and cytokine production in response to CD3 stimulation; (v) the capacity of inducing tolerance to skin allotransplantation in mice by the injection of DCs treated with fragments of Hsp60 or by the injection of the antibody DEC205-N3. The interaction of Hsp60 fragments with the different DCs induced a modification in the expression of coestimulatory molecules and in the production of cytokines. Some peptides stood out as predominately inductors of immunoregulatory cytokines (IL-10 and TGF-; peptides p277 and N7), and others as predominately inductors of pro-inflammatory cytokines (TNF-, IFN- and IL-12; peptides I8 and I2). In addition, the peptide N7 was the greatest inhibitor of the expression of coestimulatory molecules, while the protein CHsp60 at times increased, and at times decreased this expression. The peptide N7 presented a dominant effect in the inhibition of autoreactivity of TLs directed to the DCs, both in proliferative response and in the production of cytokines, especially inflammatory ones. Some fragments of Hsp60 (C-Hsp60, p277 and especially the peptide N7) were capable of inhibiting proliferation and production of inflammatory cytokines in cocultures of TLs with DCs stimulated with CD3 antibody. Despite the dual functional activity of Hsp60 in the interaction with DCs, in vitro, in this work we observed a predominance of immunoregulation. We highlight that the peptide N7 presented the most immunoregulatory profile. Our data suggest the involvement of multiple mechanisms of action for the immunoregulatory activity of Hsp60 in the interaction with DCs. Although our protocols have not induced tolerance to the skin allograft in mice, we have observed that the animals injected with the IL-10 iDCS treated either with p277 or N7 presented increased allograft survival (16 and 17 days versus 14 days). Therefore, we believe that these protocols for tolerance induction can be optimized for the use in murine models, aiming future applications in the clinic in transplants and auto-immune diseases

A indução de tolerância ao alotransplante, sem auxílio de drogas imunossupressoras é um dos maiores desafios da Imunologia. Considerando o potencial tolerogênico das células dendríticas e a atividade imunorreguladora da Hsp60, objetivamos determinar a capacidade das células dendríticas (DCs) na interação com a Hsp60, de induzir imunorregulação, in vitro, e tolerância ao aloenxerto de pele, no sistema murino. Para tal, geramos três tipos de DCs derivadas de células da medula óssea de camundongos Balb/c: DCs imaturas (iDCs e iDCs IL-10 tratadas com IL-10) e DCs maduras (mDCs). As DCs foram caracterizadas quanto à sua: (i) morfologia, (ii) imunofenótipo, (iii) estabilidade do fenótipo imaturo; (iv) produção espontânea de citocinas; (v) resposta linfocitária alogenéica. Os três tipos de DCs gerados, neste trabalho, (mDCs, iDCs e iDCs IL- 10) apresentaram diferenças imunofenotípicas e funcionais em relação à estimulação de uma resposta proliferativa alogenéica. As mDCs tiveram maior expressão de moléculas coestimuladoras e maior indução de proliferação de linfócitos T (LT) alogenéicos. As iDCs IL-10 apresentaram estabilidade do fenótipo imaturo, após desafio com LPS e mostraram baixa capacidade de induzir proliferação de LT alogenéicos. Não observamos um perfil diferencial em relação à produção espontânea de citocinas pelos três tipos de DCs, no tempo analisado. No entanto, TNF- foi a citocina mais freqüentemente detectada nos 3 tipos de DCs, principalmente nas mDCs, enquanto que a IL-6 foi produzida em maiores quantidades pelas mDCs e a IL-10 pelas iDCs IL-10. Após a caracterização das diferentes DCs, estas células foram tratadas com os fragmentos da Hsp60, por 24 horas. Avaliamos se esses fragmentos tiveram a capacidade de modificar nas DCs: (i) a expressão de moléculas coestimuladoras; (ii) a produção de citocinas; (iii) a capacidade de induzir e inibir proliferação e citocinas em coculturas autólogas; (iv) a capacidade de inibir proliferação e a produção de citocinas em resposta ao estímulo de CD3; (v) a capacidade de induzir tolerância ao transplante de pele em camundongos via injeção de DCs tratadas com fragmentos da Hsp60 ou com a injeção do anticorpo DEC205-N3. A interação dos fragmentos da Hsp60 com as diferentes DCs induziu modificação na expressão de moléculas coestimuladoras e na produção de citocinas. Alguns peptídeos se destacaram como predominantemente indutores de citocinas imunorreguladoras, (IL-10 e TGF-; peptídeos p277 e N7), e outros como predominantemente indutores de citocinas pró-inflamatórias (TNF-, IFN- e IL-12; peptídeos I8 e I2). Além disso, o peptídeo N7 foi o maior inibidor da expressão de moléculas coestimuladoras, enquanto a proteína C-Hsp60 ora aumentou ora inibiu essa expressão. O peptídeo N7 teve um efeito dominante na inibição da auto-reatividade de LT dirigida às DCs, tanto proliferativa como na produção de citocinas, principalmente inflamatórias. Alguns fragmentos da Hsp60 (C-Hsp60, p277 e principalmente o peptídeo N7) foram capazes de, em alguns experimentos, inibir a proliferação e a produção de citocinas inflamatórias das coculturas de LT com DCs estimuladas com o anticorpo CD3. Apesar da dupla atividade funcional da Hsp60 na interação com as DCs observada, in vitro, nesse trabalho, houve um predomínio de imunorregulação. Destacamos que o peptídeo N7 teve o perfil mais imunorregulador. Nossos dados sugerem o envolvimento de múltiplos mecanismos de ação para a atividade imunorreguladora da Hsp60, na interação com as DCs. Apesar dos nossos protocolos não terem induzido tolerância ao aloenxerto de pele em camundongos, observamos que os animais injetados com as iDCs IL-10 tratadas com p277 ou N7, tiveram uma maior sobrevida do enxerto (16 e 17 dias versus 14 dias). Assim, acreditamos que esses protocolos de indução de tolerância possam ser otimizados para o uso em modelos murinos, visando futuras aplicações na clínica em transplantes e doenças auto-imunes. / The induction of tolerance to allotransplant without the help of immunosupressive drugs is one of the major challenges in immunology. Considering the tolerogenic potential of dendritic cells and the immunoregulatory activity of Hsp60, our objective was to determine the capacity of dendritic cells (DCs) of inducing immunoregulation through the interaction with Hsp60, in vitro, and tolerance to the skin allograft, in the murine system. For this, we have generated three types of DCs derived from bone marrow of Balb/c mice: immature DCs (iDCs and IL-10 iDCs treated with IL-10) and mature DCs (mDCs). The DCs were characterized as to their: (i) morphology, (ii) immunophenotype, (iii) immature phenotype stability; (iv) spontaneous cytokine production; (v) induction of allogeneic LT proliferation. The three types of DCs generated in this work (mDCs, iDCs and IL-10 iDCs) have presented immunophenotypic and functional differences in relation to the stimulation of allogeneic proliferative response. The mDCs presented the highest expression of coestimulatory molecules and the strongest induction of allogeneic T lymphocyte proliferation. The IL-10 iDCs presented stability of the immature phenotype after LPS challenge and showed low capacity of inducting allogeneic TL proliferation. We did not observe a differential profile in relation to the spontaneous cytokine production by all three types of DCs in the period analyzed. However, TNF- was the most frequent cytokine detected in the three types of DCs, especially in the mDCs, while IL-6 was mostly produced by mDCs, and IL-10 by IL-10 iDCs. After the characterization of the different DCs, these cells were treated with the fragments of Hsp60 for 24 hours. We evaluated if these fragments had the capacity of modifying in the DCs: (i) the expression of coestimulatory molecules; (ii) the production of cytokines; (iii) the capacity of inducing and inhibiting proliferation and cytokine in autologous cocultures; (iv) the capacity of inhibiting proliferation and cytokine production in response to CD3 stimulation; (v) the capacity of inducing tolerance to skin allotransplantation in mice by the injection of DCs treated with fragments of Hsp60 or by the injection of the antibody DEC205-N3. The interaction of Hsp60 fragments with the different DCs induced a modification in the expression of coestimulatory molecules and in the production of cytokines. Some peptides stood out as predominately inductors of immunoregulatory cytokines (IL-10 and TGF-; peptides p277 and N7), and others as predominately inductors of pro-inflammatory cytokines (TNF-, IFN- and IL-12; peptides I8 and I2). In addition, the peptide N7 was the greatest inhibitor of the expression of coestimulatory molecules, while the protein CHsp60 at times increased, and at times decreased this expression. The peptide N7 presented a dominant effect in the inhibition of autoreactivity of TLs directed to the DCs, both in proliferative response and in the production of cytokines, especially inflammatory ones. Some fragments of Hsp60 (C-Hsp60, p277 and especially the peptide N7) were capable of inhibiting proliferation and production of inflammatory cytokines in cocultures of TLs with DCs stimulated with CD3 antibody. Despite the dual functional activity of Hsp60 in the interaction with DCs, in vitro, in this work we observed a predominance of immunoregulation. We highlight that the peptide N7 presented the most immunoregulatory profile. Our data suggest the involvement of multiple mechanisms of action for the immunoregulatory activity of Hsp60 in the interaction with DCs. Although our protocols have not induced tolerance to the skin allograft in mice, we have observed that the animals injected with the IL-10 iDCS treated either with p277 or N7 presented increased allograft survival (16 and 17 days versus 14 days). Therefore, we believe that these protocols for tolerance induction can be optimized for the use in murine models, aiming future applications in the clinic in transplants and auto-immune diseases

Há dados na literatura indicando que as células que saem do timo com o fenótipo CD4+CD25+ são desenvolvidas continuamente como uma linhagem independente e possuem um papel importante no processo de regulação da resposta imune. Essas células são chamadas células T reguladoras naturais. Várias questões sobre estas células permanecem em aberto, como por exemplo, como elas são geradas, o que é determinante na sua atividade reguladora e que marcadores específicos podem ser usados para identificá-las? Dentro deste contexto, o nosso objetivo neste trabalho foi identificar no timo e em timócitos CD4+/CD25+ humanos, novas moléculas potencialmente importantes no desenvolvimento e/ou na atividade supressora das células T reguladoras naturais. Para este objetivo, utilizamos a abordagem de phage display, com uma biblioteca de fagos de peptídeos, e timos humanos obtidos de pacientes portadores de cardiopatias congênitas, submetidos a cirurgias cardíacas realizadas no InCor. A busca dessas moléculas foi feita, separadamente, em 3 tipos de material biológico: timócitos totais, fragmento do tecido tímico e timócitos CD4+/CD25+. Antes da incubação da biblioteca de fagos com os timócitos totais e timócitos CD4+/CD25+ (separação em FACS), foi realizada uma etapa de preclearing, incubando-se a biblioteca de fagos com um pool de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou timócitos CD4+/CD25-, respectivamente. Os fagos não ligantes, recuperados desta etapa, foram então incubados com as células de interesse. Para o tecido tímico não foi feita etapa de pre-clearing. Os fagos obtidos com os diferentes materiais biológicos foram recuperados em cultura de bactérias e usados em ciclos posteriores de seleção. Após três ciclos de seleção, os fagos foram seqüenciados e identificados quanto à expressão de peptídeos ligantes para timócitos totais, timo e timócitos CD4+/CD25+, e analisados em bancos de dados no BLAST. Os fagos selecionados para validação um ligante de tecido tímico: M2C e um ligante de timócitos CD4+/CD25+: R2A fazem similaridade a duas proteínas associadas ao metabolismo da Vitamina D3, molécula envolvida em imunorregulação e indução de tolerância, em diversos modelos experimentais. Porém, não há dados na literatura a respeito do seu papel em células T reg naturais. Na validação molecular desses fagos, apesar de certa variabilidade entre os diferentes ensaios, verificamos, por ELISA, que os fagos se ligam preferencialmente a 1,25 diidroxivitamina D3, forma ativa da Vitamina D3. Entretanto, nos ensaios de validação funcional, a influência da vitamina D na diferenciação dessas células não foi confirmada de forma consistente, uma vez que só tivemos aumento no número de células CD4+/CD25+, em cultura com Vitamina D, em poucos experimentos. As moléculas identificadas no presente estudo podem ter implicações relevantes no processo de diferenciação e na atividade de células T CD4+CD25+ reguladoras e serão mais investigadas na continuidade deste trabalho. / There are consistent data in literature indicating that thymic CD4+CD25+ cells play an important role in immune regulation and are continuously developed as an independent lineage in the thymus. These cells are known as natural regulatory T cells. Several questions about these cells remain unanswered, such as how they are generated, what is determinant in their regulatory function and which specific molecular markers can be used to identify them. Taking this into consideration, our aim was to identify new potentially important molecules in the development and/or supressive function of natural regulatory T cells, both in the thymus and in CD4+CD25+ thymocytes. For this, the phage display technique was employed, with a peptide phage library and thymic specimens obtained from children who underwent corrective cardiac surgery at the Heart Institute (InCor), in São Paulo. The search for these molecules was separately performed in 3 types of biological material: thymic tissue, thymocytes and CD4+CD25+ thymic cells. In the first stage, the phage peptide-library was incubated with a pool of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). After the incubation, phages bound to PBMC were discarded (pre-clearing). In the second stage, unbound phages were incubated with either total thymocytes or CD4+CD25+ thymic cells. The pre-clearing stage was not perfomed in the thymic tissue. The phages obtained with after incubation with the different biological materials were recovered in E. coli culture and used in additional cycles of selection. After three rounds of selection, the recovered phages from the total thymocytes, from thymic tissue and thymocytes CD4+CD25+ were sequenced and their ligands identified. Among the phages selected for validation one ligand of thymic tissue: M2C and one ligand of CD4+CD25+ thymocytes: R2A present similarity to two proteins associated to the metabolism of Vitamin D3, a molecule involved in imunoregulation and toelrance induction in several experimental models. However, there are no data in the literature concerning the possible role of this moelcule in natural regulatory T cells. In the molecular validation of theses phages, although some variability between the diffeterent assays we have verified by ELISA, that the phages present preferential binding to the 1,25 dhydroxyvitamin D3, the active form of Vitamin D3. However, in the functional validation assays, the influence of the Vitamin D3 in the differentiation of these cells could not be consistently confirmed since we could observe an increase in the number of CD4+CD25+ cells cultured with vitamin D in only a few experiments. The ligand-receptor molecules we have defined in this study may have relevant implications in the development of CD4+CD25+ regulatory T cells in the thymus

Há dados na literatura indicando que as células que saem do timo com o fenótipo CD4+CD25+ são desenvolvidas continuamente como uma linhagem independente e possuem um papel importante no processo de regulação da resposta imune. Essas células são chamadas células T reguladoras naturais. Várias questões sobre estas células permanecem em aberto, como por exemplo, como elas são geradas, o que é determinante na sua atividade reguladora e que marcadores específicos podem ser usados para identificá-las? Dentro deste contexto, o nosso objetivo neste trabalho foi identificar no timo e em timócitos CD4+/CD25+ humanos, novas moléculas potencialmente importantes no desenvolvimento e/ou na atividade supressora das células T reguladoras naturais. Para este objetivo, utilizamos a abordagem de phage display, com uma biblioteca de fagos de peptídeos, e timos humanos obtidos de pacientes portadores de cardiopatias congênitas, submetidos a cirurgias cardíacas realizadas no InCor. A busca dessas moléculas foi feita, separadamente, em 3 tipos de material biológico: timócitos totais, fragmento do tecido tímico e timócitos CD4+/CD25+. Antes da incubação da biblioteca de fagos com os timócitos totais e timócitos CD4+/CD25+ (separação em FACS), foi realizada uma etapa de preclearing, incubando-se a biblioteca de fagos com um pool de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou timócitos CD4+/CD25-, respectivamente. Os fagos não ligantes, recuperados desta etapa, foram então incubados com as células de interesse. Para o tecido tímico não foi feita etapa de pre-clearing. Os fagos obtidos com os diferentes materiais biológicos foram recuperados em cultura de bactérias e usados em ciclos posteriores de seleção. Após três ciclos de seleção, os fagos foram seqüenciados e identificados quanto à expressão de peptídeos ligantes para timócitos totais, timo e timócitos CD4+/CD25+, e analisados em bancos de dados no BLAST. Os fagos selecionados para validação um ligante de tecido tímico: M2C e um ligante de timócitos CD4+/CD25+: R2A fazem similaridade a duas proteínas associadas ao metabolismo da Vitamina D3, molécula envolvida em imunorregulação e indução de tolerância, em diversos modelos experimentais. Porém, não há dados na literatura a respeito do seu papel em células T reg naturais. Na validação molecular desses fagos, apesar de certa variabilidade entre os diferentes ensaios, verificamos, por ELISA, que os fagos se ligam preferencialmente a 1,25 diidroxivitamina D3, forma ativa da Vitamina D3. Entretanto, nos ensaios de validação funcional, a influência da vitamina D na diferenciação dessas células não foi confirmada de forma consistente, uma vez que só tivemos aumento no número de células CD4+/CD25+, em cultura com Vitamina D, em poucos experimentos. As moléculas identificadas no presente estudo podem ter implicações relevantes no processo de diferenciação e na atividade de células T CD4+CD25+ reguladoras e serão mais investigadas na continuidade deste trabalho. / There are consistent data in literature indicating that thymic CD4+CD25+ cells play an important role in immune regulation and are continuously developed as an independent lineage in the thymus. These cells are known as natural regulatory T cells. Several questions about these cells remain unanswered, such as how they are generated, what is determinant in their regulatory function and which specific molecular markers can be used to identify them. Taking this into consideration, our aim was to identify new potentially important molecules in the development and/or supressive function of natural regulatory T cells, both in the thymus and in CD4+CD25+ thymocytes. For this, the phage display technique was employed, with a peptide phage library and thymic specimens obtained from children who underwent corrective cardiac surgery at the Heart Institute (InCor), in São Paulo. The search for these molecules was separately performed in 3 types of biological material: thymic tissue, thymocytes and CD4+CD25+ thymic cells. In the first stage, the phage peptide-library was incubated with a pool of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). After the incubation, phages bound to PBMC were discarded (pre-clearing). In the second stage, unbound phages were incubated with either total thymocytes or CD4+CD25+ thymic cells. The pre-clearing stage was not perfomed in the thymic tissue. The phages obtained with after incubation with the different biological materials were recovered in E. coli culture and used in additional cycles of selection. After three rounds of selection, the recovered phages from the total thymocytes, from thymic tissue and thymocytes CD4+CD25+ were sequenced and their ligands identified. Among the phages selected for validation one ligand of thymic tissue: M2C and one ligand of CD4+CD25+ thymocytes: R2A present similarity to two proteins associated to the metabolism of Vitamin D3, a molecule involved in imunoregulation and toelrance induction in several experimental models. However, there are no data in the literature concerning the possible role of this moelcule in natural regulatory T cells. In the molecular validation of theses phages, although some variability between the diffeterent assays we have verified by ELISA, that the phages present preferential binding to the 1,25 dhydroxyvitamin D3, the active form of Vitamin D3. However, in the functional validation assays, the influence of the Vitamin D3 in the differentiation of these cells could not be consistently confirmed since we could observe an increase in the number of CD4+CD25+ cells cultured with vitamin D in only a few experiments. The ligand-receptor molecules we have defined in this study may have relevant implications in the development of CD4+CD25+ regulatory T cells in the thymus