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Previous issue date: 2013-12-17 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os nanotubos de carbono multicamadas (MWCNT) e as nanofibras de celulose (NFCs) são
interessantes nanomateriais (NMs) que possuem grande potencial de aplicação em áreas como
tratamento de água, reforço de materiais, engenharia tecidual e entrega de moléculas
terapêuticas. Em especial, os MWCNT são promissores vetores de DNA em células e
embriões de mamíferos. Porém, o desenvolvimento desta área está relacionado à padronização
de sistemas para avaliar o potencial impacto dos NMs na saúde humana e ambiental. O
objetivo geral deste estudo foi avaliar a toxicidade de MWCNT e NFC em diferentes modelos
biológicos (fibroblastos e embriões bovinos; microalgas) e o potencial de carreamento gênico
de MWCNT-COOH em fibroblastos e embriões bovinos. No experimento 1, foi avaliada a
viabilidade e a morfologia dos fibroblastos cultivados in vitro expostos às NFCs e aos
MWCNT-COOHs. Os resultados deste experimento revelaram que em baixas concentrações
(0,02-100μg ml-1) as NFC não foram citotóxicas (P = 0,06). Porém, concentrações acima de
200 μg ml-1 NFC diminuíram a viabilidade celular e causaram mudanças na morfologia das
células. Para os MWCNT-COOH, a exposição dos fibroblastos a 100μg ml-1 reduziram a
viabilidade (P= 0,001) e alteram a morfologia celular. No experimento 2, foram analisados os
efeitos desses NMs no desenvolvimento, expressão gênica e apoptose in situ de embriões
bovinos produzidos in vitro. Neste ensaio, os NMs não influenciaram o desenvolvimento
(P=0,24) e o índice de apoptose embrionária (P=0,82). Contudo, os MWCNT-COOH
alteraram a expressão de genes (P=0,02) relacionados à totipotência, diferenciação e estresse
celular de forma mais acentuada quando comparada às NFCs. No experimento 3, o potencial
ecotóxico das NFCs e dos MWCNTs foi estudado em microalgas Chlorella vulgaris e
Klebsormidium flaccidum mediante análise de Potencial Zeta, viabilidade celular, atividade
fotossintética e de enzimas antioxidativas, quantificação dos níveis de ATP e microscopia
eletrônica. Os resultados revelaram que os MWCNTs e as NFCs afetaram a viabilidade
(P<0,001), a fotossíntese (P<0,05), a atividade de enzimas antioxidativas (P<0,05), os níveis
de ATP (P<0,05) e a morfologia celular das microalgas em concentrações, tempos e sistemas
de cultura específicos. No experimento 4, os fibroblastos e embriões bovinos foram
transfectados com MWCNT-COOH complexados ao plasmídeo contendo o gene que codifica
a proteína verde fluorescente (pGFP). As análises de microscopia de fluorescência detectaram
que o gene GFP foi expresso nas células e nos embriões no estágio inicial de desenvolvimento
(2 a 8 células). Entretanto, a expressão de GFP não foi observada no estágio de blastocisto. A
análise por PCR confirmou a presença do gene GFP nos fibroblastos (3,30% GFP+) e
embriões de 2-8–células (46,67% GFP+). Em conclusão, nas condições testadas, a exposição
de fibroblastos a baixas concentrações de MWCNT-COOH ou NFC não causaram impacto na
viabilidade e morfologia celular. Entretanto, os MWCNTs e as NFCs foram citotóxicas para
as microalgas estudadas. O uso de MWCNT-COOH como vetor de DNA em embriões
bovinos mostrou-se promissora, o que abre possibilidades de geração de animais transgênicos
por este método. / Multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) and cotton cellulose nanofibers (CNFs) are
interesting nanomaterials (NMs) which possess great potential for applications in various
fields such as in water treatment, reinforcement materials, tissue engineering and therapeutic
molecule delivery. In particular, MWCNT have emerged as a new method for gene delivery
and they can be an alternative for cell and embryos transfection. However, while engineered
NMs provide great benefits, we know very little about the potential effects on human health
and the environment. Thus, the objectives of this study were to evaluate the potential toxicity
of MWCNT and CNF in various biological model organisms (bovine fibroblast and embryo,
and green microalgaes) and whether MWCNT is able to deliver exogenous DNA molecules
into bovine fibroblast and embryos. In experiment 1, we evaluated in vitro the effects of NMs
on bovine fibroblast viability and morphology. The results showed that low concentrations of
CNF (0.02-100μg ml-1) did not cause viability loss (P>0.05) or change in cell morphology.
However, at concentrations above 200μg ml-1, NFC significantly decreased cell viability
(P<0.05) and changes in cell shape. Fibroblasts exposed at concentrations above 100μg ml-1
MWCNT-COOH exhibited a reduced cell viability (P<0.05) and their cell morphology was
altered. In experiment 2, we examined gene expression, apoptosis response and
developmental rates of in vitro produced bovine embryos that were exposed to NMs. There
was no difference (P > 0.05) in the hatching, degeneration and apoptosis rate among the
control, MWCNT-COOH or cotton CNF- exposed embryos. In contrast, in embryos exposed
at 0.2 μg ml-1 MWCNT-COOH showed relatively higher levels (P<0.05) of the genes
associated with totipotency, differentiation and response to stress. In experiment 3, we
analyzed the cytotoxic response of C. vulgaris and K. flaccidum cells (green microalgae) to
NMs by investigating the zeta potential, trypan blue exclusion assay, photosynthetic activity,
superoxide dismutase activity, quantification of ATP levels and microscopic investigations.
NMs decreased viability, photosynthetic activity and ATP levels of microalgaes cells,
depending on concentration and time. Addition of NMs further induced an increase of
superoxide dismutase activity and ultrastructural damage cell. In experiment 4, we have used
plasmid DNA of green fluorescent protein (pGFP) in combination with MWCNT-COOH to
transfect bovine fibroblast and embryos. Detection of GFP accumulation by fluorescence
microscopy examination revealed that this gene was expressed in the fibroblast and the
embryo (2 to 8-cell stage). However, the expression GFP was not observed in blastocyst
stage. The PCR result confirmed the presence of the pGFP gene in the transfected cells
(3.30% GFP+) and embryos of 2-8–cell stage (46.67% GFP+). In conclusion, under the
conditions tested, the exposures to MWCNTs or CNFs in low concentrations are not toxic to
bovine fibroblast cells. However, these NMs have toxic effects in green microalgaes.
Especially, this work showed that MWCNT-COOH-transfection of embryo could be a simple
and suitable method to introduce foreign genes in embryos and perhaps could be also useful to
generate transgenic animals.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:hermes.cpd.ufjf.br:ufjf/1172 |
| Date | 17 December 2013 |
| Creators | Pereira, Michele Munk |
| Contributors | Raposo, Nádia Rezende Barbosa, Brandão, Humberto de Mello, Brandão, Marcos Antônio Fernandes, Maranduba, Carlos Magno da Costa, Brayner, Roberta, Serapião, Raquel Varella |
| Publisher | Universidade Federal de Juiz de Fora, Programa de Pós-graduação em Saúde Brasileira, UFJF, Brasil, Faculdade de Medicina |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFJF, instname:Universidade Federal de Juiz de Fora, instacron:UFJF |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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